一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用，包括非天然氨基酸，物偶联)和蛋白功能研究提供了全新的方法，所述非天然氨基酸与且仅与特异性氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸等)发生共价反应，无需诱导(近距离自发反应)且具有高选择性，课题组运用遗传编码非天然氨基酸技术，结合化学生物学、分子生物学、细胞生物学、模式生物等手段研究蛋白表观修饰在免疫中的调控机制并开发相关药。本发明专利技术通过美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。从而被染成蓝色或淡蓝色。从而被染成蓝色或淡蓝色。

An effector protein and its application in host regulation

【技术实现步骤摘要】
一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用


[0001]本专利技术涉及效应蛋白
，具体为一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用。

技术介绍

[0002]效应蛋白的简单意义上讲就是病原物的毒性基因；由细菌引起的疾病严重危害人类健康，给社会造成巨大的经济损失和负担，并给国家安全带来隐患(生物防恐)。许多病原菌通过特殊分泌系统将一系列毒力蛋白(效应因子)注入宿主细胞内。这些效应因子与宿主蛋白相互作用，抑制宿主细胞的炎症、吞噬溶酶体途径、细胞自噬等过程，实现其感染和致病。效应蛋白作用机制及活性的阐明，有助于全方位了解病原菌的致病机制，为诊断和防治病原菌引起的疾病提供新的药物靶点。此外，效应蛋白不仅表现出对宿主蛋白作用机制的模拟，同时还具有全新的生物学和酶学活性，指导我们更清晰的了解宿主信号转导的调控机制；
[0003]近年来，人们发现了多种效应因子通过蛋白翻译后修饰(如泛素化，去磷酸化及甲基化)宿主细胞蛋白，抑制宿主天然免疫等重要通路。肠道病原菌(EPEC)的效应蛋白NleB(non
‑
LEE encoded effector B)通过糖基化修饰死亡结构域蛋白的精氨酸，抑制宿主死亡信号通路。肠道致病菌中高度保守的III型分泌系统效应器NleE(non
‑
LEE encoded effector E)通过甲基化修饰宿主蛋白Tab2/Tab3锌指结构域中半胱氨酸，破坏其结合泛素链的能力，抑制NF
‑
κB炎症通路激活。NleE催化的Tab2/Tab3半胱氨酸甲基化是蛋白质发生酶促半胱氨酸甲基化的第一个例子，揭示了一种新的蛋白质翻译后修饰在调节信号转导中的关键作用。进一步研究筛选了多于50个C2H2锌指蛋白和所有的C4锌指蛋白，仅鉴定出ZRANB3为NleE的底物。我们的前期研究发现NleE影响宿主细胞自噬水平，激励我们探索NleE在宿主细胞中的未知作用机制。然而，蛋白酶与底物之间相互作用一般较弱且瞬时，相互作用的捕捉面临巨大的困难。遗传密码扩展技术为活体细胞内瞬间及弱的蛋白相互作用的捕捉和功能。
[0004]研究提供新的方法和思路。我们首先以半胱氨酸甲基转移酶NleE为切入点，利用开发的自发与半胱氨酸反应的选择性非天然氨基酸系列(Nature Methods，Angew Chem IntEd)，共价捕捉NleE在宿主细胞中的作用底物，探索其作用机制。具体研究内容主要包括：
[0005]1、哺乳动物细胞内遗传编码BetY改造NleE蛋白；
[0006]2、活体细胞内NleE作用底物的鉴定；
[0007]3、解析NleE与底物(PSMD10、ZFR2和PLAGL2)的相互作用模式；
[0008]4、探索NleE与底物相互作用的功能及作用机制；
[0009]5、探索干预NleE与底物相互作用在病原菌治疗中的应用潜能。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用，以解决上述背景
技术中提出的需要对压缩机与数据采集设备进行固定安装，来避免压缩机在振动测试时发生倾倒、只能单一的对振动数据进行采集，无法同时对压缩机的噪音进行采集和结构较为复杂，采集方法较为繁琐的相关问题。
[0011]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用，包括非天然氨基酸，物偶联)和蛋白功能研究提供了全新的方法，所述非天然氨基酸与且仅与特异性氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸等)发生共价反应，无需诱导(近距离自发反应)且具有高选择性，课题组运用遗传编码非天然氨基酸技术，结合化学生物学、分子生物学、细胞生物学、模式生物等手段研究蛋白表观修饰在免疫中的调控机制并开发相关药，具体研究方向主要包括。
[0012]S1、哺乳动物细胞内遗传编码BetY改造NleE蛋白；
[0013]S2、活体细胞内NleE作用底物的鉴定；
[0014]S3、解析NleE与底物(PSMD10、ZFR2和PLAGL2)的相互作用模式；
[0015]S4、探索NleE与底物相互作用的功能及作用机制；
[0016]S5、探索干预NleE与底物相互作用在病原菌治疗中的应用潜能；
[0017]优选的，所述哺乳动物细胞内遗传编码；包括线粒体DNA，所述线粒体DNA呈双链环状，一个线粒体中可有1个或几个DNA分子，所述线粒体DNA先复制，随后线粒体分裂，其复制仍受细胞核的控制，复制所需要的线粒体DNA聚合酶是由核DNA编码，在细胞质核糖体上合成的，线粒体DNA能改造NleE蛋白。
[0018]优选的，所述NleE作用底物的鉴定；包括化学染色法和荧光染色法，所述NleE作用底物可以通过台盼蓝来进行鉴定NleE细胞为活性还是死型。
[0019]优选的，所述NleE与底物的相互作用模式；包括NLeE+S＝＝＝＝NLeE
‑
S
‑‑‑‑
P+E。
[0020]优选的，所述底物＝S，且底物分别为PSMD10、ZFR2和PLAGL2。
[0021]优选的，根据权利要求S4所述的一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用，其特征在于，包括如下步骤。
[0022]S401、邻近效应；NleE与底物形成中间复合物后使底物之间、NleE的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有限浓度，使反应速率大大增加。
[0023]S402、定向效应；由于NleE的构象作用，当底物和NleE的反应中心结合后，在NleE的反应中心活性基团的作用和诱导下，使底物的反应基团按照最佳方式定向和定位，大大增加反应速率。
[0024]S403、多功能摧化作用；NleE的活性中心部位，一般含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态。
[0025]优选的，所述NleE与底物相互作用在病原菌治疗中的应用潜能；包括，NleE与底物反应过渡态结合。
[0026](1)、根据过渡态的结构设计的过渡态类似物可作为NleE的强抑制剂，抑制效果远高于竞争性抑制剂。
[0027](2)、利用过渡态类似物作为抗原或半抗原，去免疫动物，由此产生的抗体可能有类似NleE的催化作用。
[0028](3)、NleE与过渡态的结合主要有两种方式:非共价结合方式，和共价结合方式，后
者被称为共价催化。
[0029]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0030](1)该效应蛋白及其在调控宿主中的应用，通过台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色，是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据，美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色，由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色，而死细胞或代谢缓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用，包括非天然氨基酸，其特征在于：所述非天然氨基酸为蛋白质药物改造(如蛋白药物稳定，位点特异性抗体药物偶联)和蛋白功能研究提供了全新的方法，所述非天然氨基酸与且仅与特异性氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸等)发生共价反应，无需诱导(近距离自发反应)且具有高选择性，课题组运用遗传编码非天然氨基酸技术，结合化学生物学、分子生物学、细胞生物学、模式生物等手段研究蛋白表观修饰在免疫中的调控机制并开发相关药，具体研究方向主要包括。S1、哺乳动物细胞内遗传编码BetY改造NleE蛋白；S2、活体细胞内NleE作用底物的鉴定；S3、解析NleE与底物(PSMD10、ZFR2和PLAGL2)的相互作用模式；S4、探索NleE与底物相互作用的功能及作用机制；S5、探索干预NleE与底物相互作用在病原菌治疗中的应用潜能。2.根据权利要求1所述的一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用，其特征在于：所述哺乳动物细胞内遗传编码；包括线粒体DNA，所述线粒体DNA呈双链环状，一个线粒体中可有1个或几个DNA分子，所述线粒体DNA先复制，随后线粒体分裂，其复制仍受细胞核的控制，复制所需要的线粒体DNA聚合酶是由核DNA编码，在细胞质核糖体上合成的，线粒体DNA能改造NleE蛋白。3.根据权利要求1所述的一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用，其特征在于：所述NleE作用底物的鉴定；包括化学染色法和荧光染色法，所述NleE作用底物可以通过台盼蓝来进行鉴定NleE细胞为活性还是死型。4.根据权利要求1所述的一种效应蛋白及其在调控宿主中的应用，其特征在于：所述NleE与底物的相互作用...

【专利技术属性】
技术研发人员：任海燕，
申请(专利权)人：成都芃光生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：