一种生物合成NMN的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌生物合成NMN的方法。所述工程菌是在大肠杆菌宿主中，通过缺失对烟酰胺核苷酸酰胺酶编码基因pncC、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因nadD、nadR的表达的同时，过表达NAD

A method of biosynthesis of NMN

【技术实现步骤摘要】
一种生物合成NMN的方法

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[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种重组大肠杆菌生物合成NMN的方法。

技术介绍
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[0002]作为生命体内200多种还原反应的辅酶，NAD是3类NAD消耗酶的底物，在多种细胞的生理过程中起着至关重要的作用，NAD的生物能量状态甚至决定了细胞的生死存亡。同时，NAD的代谢在健康和疾病状态中起着重要作用，逐渐引起人们的关注，因此参与NAD生物合成和代谢的酶也成为了疾病治疗中具有关注热度的药物靶标。
[0003]NMN(nicotinamide mononucleotide)，即烟酰胺单核苷酸，是一种自然存在的生物活性核苷酸，NMN作为细胞内参与NAD合成的重要底物，在人体细胞能量生成中扮演重要角色。NMN是人体内原本存在的物质，但随着年龄的增长而减少。在哺乳动物体内，NMN主要由烟酰胺在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase，Nampt)的催化作用下生成，随后NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的催化下生成NAD
+
。在细胞外的NMN则需要脱去磷酸转化为烟酰胺核糖(NR)才能进入肝细胞内部，进入胞内后，烟酰胺核糖在烟酰胺核苷激酶的作用下再磷酸化生成NMN，随后NMN和ATP结合生成NAD+。
[0004]目前NMN合成主要通过化学催化与酶催化进行。传统的体外制备β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法为化学合成法，催化NMN时需要用到危险化学品和大量的有机溶剂，会破坏环境且操作复杂、反应步骤多、中间产物多、得率低、产品纯化困难。比如，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在TMSOTf的催化下发生缩合反应；又比如Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应。这些化学合成方法存在成本高、收率低而且化学试剂污染大等问题。
[0005]至于酶催化，所需原料ATP比较昂贵，生产NMN的成本很高。早在1994年，Jeck等利用二磷酸吡啶核苷酸为原料，在焦磷酸化酶的催化水解下生成烟酰胺单核苷酸。2016年，深圳邦泰公司利用烟酰胺、ATP和核糖为底物，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化下生成烟酰胺单核苷酸。2017年，该公司进一步改进工艺，以烟酰胺、焦磷酸或其盐和AMP为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶和腺膘呤磷酸核糖转移酶的催化作用下发生反应，获得烟酰胺单核苷酸；该工艺优势在于使用磷酸核糖焦磷酸为原料，降低了成本。2018年，尚科生物报道以D
‑5‑
磷酸核糖、ATP和烟酰胺为原料，通过固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的活性细胞，实现了高效生物催化合成β
‑
烟酰胺单核苷酸。固定化细胞或固定化酶可以重复多次使用，利于纯化，以降低生产成本，但是合成所需原料ATP相对比较昂贵，也增加了NMN的生产成本。
[0006]因此考虑到食品安全因素以及化学催化与酶催化的环境污染问题和局限性，目前多使用生物合成法制备NMN，即通过构建工程菌使相关酶在大肠杆菌中重组表达，再进行发酵生产。最早由Marinescu等构建基因工程菌发酵合成NMN，该团队将烟酰胺磷酸核糖转移酶和5
’‑
磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosyl_pyrophosphate，PRPP)合成酶在大肠杆菌中重组表达，以尼克酰胺和乳糖为底物进行发酵生产，但最终NMN产量比较低，仅为15.4mg/L。随
后该团队还开发了分子筛色谱法分离NMN的方法，但是从色谱图发现，还是有大量尼克酰胺没有转化为NMN。分析可知，NMN合成涉及细胞能量代谢，未来可以通过高密度发酵提高单位体积的产物得率。生物合成的NMN产量比较低，且合成出NMN后有较多的途径分解NMN，最终导致NMN在微生物体内无法保存较高的含量，因此常规的生物合成手段无法解决高效发酵生产NMN的问题。

技术实现思路
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[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术通过降低或敲除了大肠杆菌菌体内降解NMN的功能基因，使产生的NMN不容易被降解。利用基因编辑技术对这些途径的基因进行敲除，并通过启动子温敏突变体的替换从而构建出了一株可以在菌体内高效保留NMN的工程菌株。另外本专利技术在该菌株中构建了一条依赖于烟酰胺、核糖的NMN的生物合成途径。然后通过易错PCR筛选技术，筛选出了一个NadV的突变体，该突变体可以在该菌株体系中更高效的生成NMN。
[0008]本专利技术提供的技术方案之一，是一株可以大量合成并积累NMN(nicotinamide mononucleotide，即烟酰胺单核苷酸)的大肠杆菌基因工程菌，所述工程菌是在大肠杆菌宿主中，缺失对烟酰胺核苷酸酰胺酶编码基因pncC、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因nadD、nadR的表达的同时，过表达NAD
+
合酶编码基因nadE来提高NMN的保留量；表达烟酸磷酸核糖转移酶突变体编码基因NadV
mu
、核糖磷酸二磷酸激酶编码基因Prs以及核糖激酶编码基因RbsK来构建依赖烟酰胺和核糖的NMN生物合成途径；
[0009]进一步地，pncC、nadR基因缺失表达的方式为基因敲除；
[0010]进一步地，nadD基因缺失表达的方式为通过CIts蛋白及PR/PL启动子温敏控制nadD基因的表达；
[0011]进一步地，nadE基因通过pET
‑
28a载体进行表达；
[0012]进一步地，NadV
mu
、Prs、RbsK基因通过质粒过表达；
[0013]优选地，采用pGEX4T3载体对NadV
mu
、Prs、RbsK基因进行过表达；
[0014]进一步地，野生型NadV基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；
[0015]进一步地，pncC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；
[0016]进一步地，nadD基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示；
[0017]进一步地，nadR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；
[0018]进一步地，nadE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示；
[0019]进一步地，Prs基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示；
[0020]进一步地，RbsK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7所示；
[0021]进一步地，烟酸磷酸核糖转移酶突变体编码基因NadV
mu
的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：11所示；烟酸磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；
[0022]进一步地，所述大肠杆菌宿主选自JM109、BL21(DE3)、Top 10、DH5α、Rosetta、Rosetta
‑
gami pLysS等；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟酸磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于，所述突变体氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示。2.权利要求1所述烟酸磷酸核糖转移酶突变体的编码基因。3.一株生产NMN的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述工程菌是在大肠杆菌宿主中，通过缺失对烟酰胺核苷酸酰胺酶编码基因pncC、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因nadD、nadR的表达的同时，过表达NAD
+
合酶编码基因nadE；表达烟酸磷酸核糖转移酶突变体编码基因NadV
mu
、核糖磷酸二磷酸激酶编码基因Prs以及核糖激酶编码基因RbsK获得的。4.如权利要求3一株生产NMN的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，pncC、nadR基因缺失表达的方式为基因敲除；nadD基因缺失表达的方式为通过CIts蛋白及PR/PL启动子温敏控制表达。5.如权利要求3一株生产NMN的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，pncC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；nadD基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示；nadR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；nadE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示；Prs基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示；RbsK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7所示；烟酸磷酸核糖转移酶突变体编码基因NadV
mu
的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：11所示。6.如权利要求3一株生产NMN的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌宿主选自JM109、BL21(DE3)、Top 10、DH5α、Rosetta、或Rose...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘月，刘超，雷伟，魏万涛，孙秋萍，刘鑫，裴亮，李乾亮，
申请(专利权)人：四川盈嘉合生科技有限公司，
类型：发明
国别省市：