转化乳糖的α-1,2-岩藻糖基转移酶制造技术

本发明专利技术涉及产生2

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转化乳糖的
α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶


[0001]本专利技术涉及产生2
’
岩藻糖基乳糖(2
’‑
FL)的方法，以及新鉴定的岩藻糖基转移酶，更具体地新鉴定的结合乳糖的α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶多肽，以及它们的应用。此外，本专利技术提供了使用新鉴定的α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶产生2
‑
岩藻糖基乳糖(2
’
FL)的方法。

技术介绍

[0002]人乳寡糖是人乳中位列乳糖和脂质后的第三大固体成分。从人乳样品中至今已经鉴定出了超过200种游离的寡糖结构。今天，超过80种HMO
‑
相关化合物已经被结构表征。这些HMO代表了一类作为益生元发挥作用的复合寡糖。另外，HMO与上皮表位的结构同源性是针对细菌病原体的保护特性的原因。在婴儿胃肠道内，HMO选择性地支持所选择的细菌菌株的生长，因此，在母乳喂养的婴儿中启动了独特的肠微生物群的发育。
[0003]母乳中存在三个主要的HMO类别：岩藻糖基化中性HMO，非岩藻糖基化中性HMO和唾液酸化酸性HMO。2
’
岩藻糖基乳糖(2
’
FL)是HMO的岩藻糖基团的一部分。在作为“分泌者”的女性中，2
’
FL是到目前为止最丰富的HMO并占所有HMO的接近30％。
[0004]岩藻糖基化寡糖的制备需要岩藻糖基转移酶的作用。此类岩藻糖基转移酶属于糖基转移酶的酶家族，在脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌、酵母和细菌中广泛表达。它们催化岩藻糖残基从供给体(通常是鸟苷
‑
二磷酸岩藻糖(GDP
‑
岩藻糖))转移到接受体，所述接受体包括二糖类，寡糖类，(糖)蛋白和(糖)脂。由此被岩藻糖基化的接受体底物参与多种生物学和病理学过程。
[0005]已经鉴定了几种岩藻糖基转移酶，例如，在细菌(幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，大肠杆菌(Escherichia coli)，肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)，耶尔森氏菌(Yersinia)，肠球菌(Enterococcus)，志贺氏菌(Shigella)，克雷伯氏菌(Klebsiella)，拟杆菌(Bacteroides))中、在哺乳动物、果蝇(Drosophila)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和曼森氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)中以及在植物中鉴定到。岩藻糖基转移酶基于岩藻糖的添加位置分类成例如α
‑
1,2、α
‑
1,3、α
‑
1,4和O
‑
岩藻糖基转移酶。
[0006]已经描述了几种α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶(2
’‑
FT)。首先报道了使用来自幽门螺杆菌的HpFucT2(Lee等人，2012，Microb Cell Fact 11:48；Chin等人，2016，Biotechnol Bioeng.113:11，2443
‑
52)或HpFutC(等人，2013，Microb Cell Fact12:40；Chin等人，2015，J.Biotechnol 210，107
‑
115；Wang等人，1999，Microbiology 145，3245
‑
3253)在被修饰用于GDP
‑
岩藻糖合成的大肠杆菌菌株中将乳糖转化成2
’
FL。利用源自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的WcfB的测试证明了与HpFucT2相比，在工程化大肠杆菌宿主中2
’
FL的产量提高(Chin等人，2017，J Biotechnol 257，192
‑
198)。其他2FT，诸如来自大肠杆菌O128的WbsJ，来自大肠杆菌O126的WbgL，来自大肠杆菌O86的WbnK和WbwK，来自大肠杆菌O127的WbiQ，来自鼬鼠螺杆菌(H.mustelae)的FutL，来自空肠弯曲菌(C.jejuni)的FutG，来自普通类杆菌(B.vulgatus)ATCC 8482的FutN，来自脆弱拟杆菌(B.fragilis)的
WcfW和来自细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)(Te2FT)的Te2FT，也被报道在工程化大肠杆菌宿主中产生2
’
FL(Chin等人，2017，J Biotechnol 257，192
‑
198；Huang等人，2017，Metab Eng41，23
‑
38；Seydametova等人，2019，Microbiol Res 222，35
‑
42；US20170081353；US20140024820)。一些2FT还被报道将GDP
‑
岩藻糖转移到乳糖上，在其他工程化细胞中引起岩藻糖基乳糖合成，所述其他工程化细胞如，例如，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum，WO2017188684)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，Liu等人，2018，ACS Synth Biol 7:11，2529
‑
2536；Yu等人，2018，Microb Cell Fact 17，101)。
[0007]然而，一般来说，需要α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶(也称作2
‑
岩藻糖基转移酶或2
‑
岩藻糖基转移酶的酶)来产生2
’
岩藻糖基乳糖，已知α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶对乳糖的亲和力低。低亲和力对2
’
岩藻糖基乳糖的产率有负面影响。为了提高转化率和产率，需要具有较高乳糖亲和力的转移酶。此外，一些α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶(如来自幽门螺杆菌)的HpFutC已知在2
’
FL合成期间产生作为不期望副产物的二岩藻糖基乳糖(diFL)，其中二岩藻糖基乳糖浓度与2
’
岩藻糖基乳糖浓度的比率高为1:5。
[0008]因此，本专利技术的目的是提供可以用来以有效的时间和成本有效的方式产生或合成2
’
岩藻糖基乳糖的工具和方法。优选地，本专利技术提供了产生大量期望产物的方法和工具，甚至更优选没有不期望副产物diFL，或如果产生diFL，则二岩藻糖基乳糖浓度与2
’
岩藻糖基乳糖浓度的比率低于1:5。

技术实现思路

[0009]出人意料地，现在发现本专利技术的新鉴定的结合乳糖的α
‑
1,2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性并且具有使用乳糖作为接受体底物的能力的多肽，其中所述多肽i)包含编码保守结构域G
‑
Y
‑
[F/Y]
‑
Q
‑
[N/S](SEQ ID NO:72)的氨基酸序列和编码保守结构域(X，不是K/V)XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X，不是C/M)(SEQ ID NO:74)的氨基酸序列，其中X可以是来自所述结构域的第一位置的除赖氨酸和缬氨酸残基以外以及来自所述结构域的最后一个位置的除半胱氨酸和甲硫氨酸残基以外的任何不同的氨基酸，和/或ii)选自由下列各项组成的组：i)附带序列表的SEQ ID NO 01，02，03，04，05，06，07，09，10，11，12，13，14，15，16，17，19，21，22，25，26，29，33，34，35，36，37，38，39，40，41，43，44，45，46，47，48，50，51，52，53，54，55，56，57，58，61，62，63，66，67或76中的任一个，或ii)与附带序列表的SEQ ID NO 01，02，03，04，05，06，07，08，09，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，65，66，67，68，69，70，75，76，77，78或79中任一个的全长氨基酸序列具有80％或更高序列同一性的氨基酸序列，或iii)SEQ ID NO 01，02，03，04，05，06，07，08，09，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，65，66，67，68，69，70，75，76，77，78或79中任一个所示的氨基酸序列的等位基因变体的氨基酸序列，或iv)SEQ ID NO 01，02，03，04，05，06，07，08，09，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，65，66，67，68，69，70，75，76，77，78或79中任一个所示的氨基酸序列的直系同源物的氨基酸序列，和v)SEQ ID NO 01，02，03，04，05，06，07，08，09，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，65，66，67，68，69，70，75，76，77，78或79中任一个所示的氨基酸片段的功能片段，优选地所述多肽属于糖基转移酶11(GT11)家族，b)使步骤a)的所述具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性的多肽与包含作为供给体底物的GDP
‑
岩藻糖和作为接受体底物的乳糖的混合物在其中所述多肽催化岩藻糖残基从所述供给体底物转移到所述接受体底物的条件下接触，由此产生α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖，c)任选地分离所述α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖。2.根据权利要求1所述的产生α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖的方法，产生的diFL浓度与2
’
岩藻糖基乳糖浓度的比率小于1:5，优选α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖纯度为80％或更高。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多肽在无细胞系统中提供。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多肽由包含编码所述多肽的多聚核苷酸的细胞产生。
5.根据权利要求1、2或4中任一项所述的方法，其中所述GDP
‑
岩藻糖和/或乳糖由产生所述GDP
‑
岩藻糖和/或乳糖的细胞提供。6.根据权利要求1、2、4或5中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：i)提供被基因修饰用于产生α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖的细胞，所述细胞包含至少一个编码用于α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖合成的酶的核酸序列，所述细胞包含所述具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性并且具有使用乳糖作为接受体底物的能力的多肽的表达，ii)将所述细胞在培养基中在容许产生α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖的条件下培养，iii)任选地从所述培养中分离所述α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖。7.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供表达所述具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性并且具有使用乳糖作为接受体底物的能力的多肽的宿主细胞，b)使所述宿主细胞在容许产生α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖且容许表达所述具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性的多肽的合适营养条件下生长；c)同时或后续向步骤b)提供供给体底物GDP
‑
岩藻糖和所述接受体底物乳糖，以使所述α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶多肽催化岩藻糖残基从GDP
‑
岩藻糖转移到乳糖，由此产生α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖；d)任选地从所述宿主细胞或其生长的培养基中分离所述α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖。8.根据权利要求6或7中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞被转化或转染以表达外源的具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性并且具有使用乳糖作为接受体底物的能力的多肽。9.根据权利要求4
‑
8中任一项所述的方法，其特征在于所述GDP
‑
岩藻糖和/或乳糖由所述宿主细胞中同时表达的酶或由所述宿主细胞的代谢提供。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其进一步包括纯化α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖。11.根据前述权利要求中任一项所述的产生2
’‑
岩藻糖基乳糖的方法，所述方法进一步包括下列步骤中的至少一个：i)向培养基中加入乳糖给料，以使每升初始反应器体积包含至少50、更优选至少75、更优选至少100、更优选至少120、更优选至少150克乳糖，其中总反应器体积的范围为250mL(毫升)
‑
10.000m3(立方米)，优选以连续方式加入，且优选使得培养基的最终体积不大于添加所述乳糖给料前培养基的体积的3倍，优选不大于2倍，更优选小于2倍；ii)向培养基中加入GDP
‑
岩藻糖给料，所述GDP
‑
岩藻糖给料的浓度使得所述宿主细胞能够合成2
’‑
岩藻糖基乳糖，其中diFL浓度与2
’
岩藻糖基乳糖浓度的比率小于1:5，优选以连续方式加入，且优选使得培养基的最终体积不大于添加所述GDP
‑
岩藻糖给料前培养基的体积的3倍，优选不大于2倍，更优选小于2倍；iii)向培养基中加入碳基底物给料，所述碳基底物给料的浓度使得所述宿主细胞能够合成最适浓度的GDP
‑
岩藻糖以用于2
’
岩藻糖基乳糖合成，其中diFL浓度与2
’
岩藻糖基乳糖浓度的比率小于1:5，优选以连续方式加入；iv)向培养基中加入碳基底物给料，所述碳基底物给料的浓度使得所述宿主细胞能够在内部合成最适浓度的乳糖以用于2
’
岩藻糖基乳糖合成；v)在1天、2天、3天、4天、5天的时程内，以连续方式借助于至少一种给料溶液向培养基
中加入乳糖给料、GDP
‑
岩藻糖给料和/或碳基底物给料；vi)在1天、2天、3天、4天、5天的时程内，以连续方式借助于给料溶液向培养基中加入乳糖给料，并且其中所述乳糖给料溶液的浓度为50g/L，优选75g/L，更优选100g/L，更优选125g/L，更优选150g/L，更优选175g/L，更优选200g/L，更优选225g/L，更优选250g/L，更优选275g/L，更优选300g/L，更优选325g/L，更优选350g/L，更优选375g/L，更优选400g/L，更优选450g/L，更优选500g/L，甚至更优选550g/L，最优选600g/L；并且其中优选所述溶液的pH设置为3
‑
7，并且其中优选所述给料溶液的温度保持在20℃
‑
80℃；vii)所述方法产生在所述培养基的最终体积中至少50g/L、优选至少75g/L、更优选至少90g/L、更优选至少100g/L、更优选至少125g/L、更优选至少150g/L、更优选至少175g/L、更优选至少200g/L的2
’‑
岩藻糖基乳糖浓度。12.被基因修饰用于产生α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含至少一个编码用于α
‑
1,2
‑
岩藻糖基乳糖合成的酶的核酸序列；所述细胞包含具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性并且具有使用乳糖作为接受体底物的能力的多肽的表达，其中所述多肽i)包含编码保守结构域G
‑
Y
‑
[F/Y]
‑
Q
‑
[N/S](SEQ ID NO:72)的氨基酸序列和编码保守结构域(X,无K/V)XXXX[I/L]H[I/L]R[R/L]GD[F/Y](X，不是C/M)(SEQ ID NO:74)的氨基酸序列，其中X可以是来自所述结构域的第一位置的除赖氨酸和缬氨酸残基以外以及来自所述结构域的最后一个位置的除半胱氨酸和甲硫氨酸残基以外的任何不同的氨基酸，和/或ii)选自由下列各项组成的组：i)附带序列表的SEQ ID NO 01，02，03，04，05，06，07，09，10，11，12，13，14，15，16，17，19，21，22，25，26，29，33，34，35，36，37，38，39，40，41，43，44，45，46，47，48，50，51，52，53，54，55，56，57，58，61，62，63，66，67或76中的任一个，或ii)与附带序列表的SEQ ID NO 01，02，03，04，05，06，07，08，09，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，65，66，67，68，69，70，75，76，77，78或79中任一个的全长氨基酸序列具有80％或更高序列同一性的氨基酸序列，或iii)SEQ ID NO 01，02，03，04，05，06，07，08，09，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，65，66，67，68，69，70，75，76，77，78或79中任一个所示的氨基酸序列的等位基因变体的氨基酸序列，或iv)SEQ ID NO 01，02，03，04，05，06，07，08，09，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，65，66，67，68，69，70，75，76，77，78或79中任一个所示的氨基酸序列的直系同源物的氨基酸序列，和v)SEQ ID NO 01，02，03，04，05，06，07，08，09，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，65，66，67，68，69，70，75，76，77，78或79中任一个所示的氨基酸片段的功能片段，优选地所述多肽属于糖基转移酶11(GT11)家族。
13.根据权利要求12所述的细胞，所述宿主细胞包含：i)包含编码所述具有结合乳糖的α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性的多肽的多聚核苷酸的序列，其中所述序列是所述宿主细胞外源的并且被整合在所述宿主细胞的基因组中，或ii)包含载体，所述载体包含编码所述多肽的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸可操作地连接到被用所述载体转化的宿主细胞识别的控制系列。14.根据权利要求12或13中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自由下列各项组成的组：微生物、植物或动物细胞，优选所述微生物是细菌、真菌或酵母，优选所述植物是稻、棉花、油菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植株，优选所述动物是昆虫、鱼类、鸟类或非人...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：因比奥斯公司，
类型：发明
国别省市：