一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术属于细胞分化技术领域，尤其涉及一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法及其应用。本发明专利技术中通过将外周血干细胞置于BM、Activin A、Wnt3a、TGF

A method for differentiation of peripheral blood stem cells into endodermal cells and its application

【技术实现步骤摘要】
一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞分化
，尤其涉及一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0002]终末期糖尿病仍是目前为止严重影响人类生存质量的重大慢性疾病，我国已经成为世界上糖尿病患病人数最多的国家。胰岛移植是目前治疗终末期糖尿病的一种有效选择方案，是具有吸引力的外科方法。胰岛移植目前采用同种异体移植方式。可以单独胰岛移植治疗糖尿病，也可和肾脏同时移植或者序贯移植治疗糖尿病并发尿毒症。然而，现阶段胰岛移植临床疗效仍不满意，其中主要的原因一是胰岛移植目前仍无法实现术后长期血糖的有效控制，只有40％
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60％的患者在移植后5年不需要依赖胰岛素；二是胰岛移植的数量要求一般不低于30万个胰岛/次，对细胞数量要求较高；三是胰岛的制备过程成本较高，从单一胰腺提取胰岛的试剂成本目前约为10万元，且提取胰岛需要在专门的试验室进行，成本较高；四是目前胰岛来源多为同种异体，移植后仍需要终生使用免疫抑制剂。为解决以上问题，近年来利用干细胞作为细胞来源，分化成为胰岛细胞后进行胰岛移植成为研究的热点。例如，近期邓宏魁团队利用人多功能干细胞直接分化制备胰岛细胞，将其移植入非人灵长类糖尿病动物模型中，系统验证了人多能干细胞分化的胰岛治疗糖尿病的安全性和有效性。此外，临床上也在一直寻找来源更常规及更广泛的干细胞作为分化来源。
[0003]外周血就是除骨髓之外的血液。临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，这样的干细胞被称为外周血干细胞。利用细胞分离技术，将外周血中含有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者以之代替骨髓而进行的干细胞移植，称为外周血干细胞移植。一些已有研究表明利用来源于自身的外周血干细胞注射至胰腺局部，从而改善胰腺功能，治疗糖尿病，这种技术的原理是外周血干细胞可能会分泌一些细胞因子，可以改善和促进胰腺功能，可以绕过同种异体胰岛移植供体不足和免疫排斥两大障碍，短期疗效较好。但是长期效果未知。临床认为，干细胞如要获得胰岛功能，还是需要分化成稳定的胰岛细胞实现。
[0004]外周血干细胞具有细胞来源广，可直接从自身获得等特点，是一个非常具有应用前景的胰岛细胞来源。而近年来已有多篇文献报道干细胞向胰岛细胞的分化需要先将干细胞分化成内胚层细胞后再利用小分子进行胰岛细胞的定向分化。这是因为胰岛细胞就是一种内胚层来源的细胞类型。而目前从内胚层细胞分化成为胰岛细胞的技术已较为成熟，而将外周血干细胞分化成内胚层细胞尚无成熟技术。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
[0006]本专利技术是这样实现的，一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法，将外周血干细胞置于BM、Activin A、Wnt3a、TGF
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b、LIF、TNF
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a、IFN
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a、vinterferron
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α,β,γ、B
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27、N2存在条件下诱导培养，得到内胚层细胞。
[0007]进一步地，所述Activin A的浓度为5
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10ng/mL，所述Wnt3a的浓度为50ng/mL，所述TGF
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b的浓度为100ng/mL，所述LIF的浓度为100ng/mL，所述TNF
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a的浓度为60ng/mL，所述IFN
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a的浓度为60ng/mL，所述vinterferron
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α,β,γ的浓度为100ng/mL，所述B
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27的含量为2％，所述N2的含量为1％。
[0008]进一步地，外周血干细胞分化过程中依次加入以下因子：
[0009]第1天：BM+Activin A 5ng/mL+Wnt3a 50ng/mL；
[0010]第2天
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第5天：BM+Activin A 5ng/mL；
[0011]第6—第11天：TGF
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b 100ng/mL+LIF 100ng/mL+TNF
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a 60ng/mL+IFN
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a 60ng/mL；
[0012]第12—18天：Activin A 10ng/mL+vinterferron
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α,β,γ100ng/mL+B
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27 2％+N
2 1％。
[0013]进一步地，外周血干细胞培养浓度为每毫升1
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3*106个细胞。
[0014]进一步地，诱导培养的条件为37℃，5％CO2条件中培养。
[0015]进一步地，每隔一天更换新的培养液。
[0016]本专利技术还提供了如上述的一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法在诱导外周血干细胞分化成内胚层细胞中的应用。
[0017]本专利技术还提供了如上述的一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法在诱导外周血干细胞分化成胰岛细胞中的应用。
[0018]本研究为一项外周血干细胞分化成内胚层干细胞的关键技术，该技术有望解决胰岛细胞来源问题和胰岛移植的异源问题，提高胰岛移植的临床效果和移植物的长期存活。
[0019]综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：
[0020]1、外周血干细胞具有细胞来源广的特点，相较于其他类型干细胞更易于获得；
[0021]2、外周血干细胞易于从自身获得，从而移植后无需考虑排斥反应，无需终身服用免疫抑制药物；
[0022]3、该技术提供了一项将外周血干细胞分化成内胚层细胞的标准方案，是对内胚层细胞分化成胰岛细胞的技术补充，加大了干细胞分化成胰岛细胞并用于胰岛移植的临床应用范围。此外，该技术可以解决常规由人胚胎干细胞定向诱导分化为内胚层细胞技术中人胚胎干细胞的成瘤性问题，因此具有创新性。
附图说明
[0023]图1是分化方案示意图；
[0024]图2是相关因子质粒转染效果；质粒转染293T细胞24小时后荧光显微镜图像，A为显微镜下明视野(x200)，B为显微镜下绿色荧光视野(x200)，图1说明质粒转染效率达到要求；
[0025]图3是慢病毒介导相关因子转染效果；慢病毒介导NKX6.1转染外周血干细胞96小时后荧光显微镜图像，A为显微镜下明视野(x200)，B为显微镜下绿色荧光视野(x200)，图2说明慢病毒转染效率达到要求；
[0026]图4是内胚层细胞转化效率图；通过本技术成功将外周血干细胞转化成内胚层细胞的转化效率图和鉴定图，其中SOX17是内胚层特异性marker。
具体实施方式
[0027]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明，各实施例及试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法，其特征在于：将外周血干细胞置于BM、Activin A、Wnt3a、TGF
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b、LIF、TNF
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a、IFN
‑
a、vinterferron
‑
α,β,γ、B
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27、N2存在条件下诱导培养，得到内胚层细胞。2.根据权利要求1所述的一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法，其特征在于：所述Activin A的浓度为5
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10ng/mL，所述Wnt3a的浓度为50ng/mL，所述TGF
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b的浓度为100ng/mL，所述LIF的浓度为100ng/mL，所述TNF
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a的浓度为60ng/mL，所述IFN
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a的浓度为60ng/mL，所述vinterferron
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α,β,γ的浓度为100ng/mL，所述B
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27的含量为2％，所述N2的含量为1％。3.根据权利要求1所述的一种外周血干细胞分化成内胚层细胞的方法，其特征在于：外周血干细胞分化过程中依次加入以下因子：第1天：BM+Activin A 5ng/mL+Wnt3a 50n...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫念樵，赵圆圆，
申请(专利权)人：宫念樵，
类型：发明
国别省市：