暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法技术

本发明专利技术公开了一种暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法。本发明专利技术的技术方案中，首先在暗纹东方鲀养殖过程中投喂经抗生素处理过的饲料；其次选取暗纹东方鲀肠道中肠部位；然后通过优化暗纹东方鲀肠上皮细胞高效分离培养技术和细胞原代培养条件，得到了纯度较高、生长良好的暗纹东方鲀肠上皮细胞；最后利用皮质醇刺激暗纹东方鲀肠上皮细胞以建立氧化应激模型。本发明专利技术为暗纹东方鲀应用于发育生物学、免疫学、毒理与环境检测等方面的研究提供有力的研究材料。究提供有力的研究材料。究提供有力的研究材料。

【技术实现步骤摘要】
暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法


[0001]本专利技术属于水产养殖领域，尤其涉及一种暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法。

技术介绍

[0002]暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)是一种溯河洄游型鱼类，大部分时间在海洋中度过，其适宜生长温度范围为23
‑
32℃，为我国长江三鲜之一，主要分布在中国近海区域及长江中下游。近年来暗纹东方鲀在中国的养殖规模也在逐渐扩大。根据《中国渔业统计年鉴》记录，2020年中国淡水养殖河鲀量超2.6万吨，其中，暗纹东方鲀的养殖量较大。鱼类的肠道是重要的渗透、酸碱调节器官，鱼体的消化能力和吸收功能依靠着肠道健康。而暗纹东方鲀养殖规模扩大的过程中，重金属、化学药品使用、外源性饲料的持续投喂等导致养殖水体污染问题日益加重，已经严重威胁到暗纹东方鲀的肠道健康，如出现炎症、肠壁变薄、肠道弹性、肠道寄生虫等问题，一旦肠道出现以上问题，肠道的消化吸收能力变弱，将严重限制饲料价值的发挥，无形中拉高了养殖成本降低了养殖效益。
[0003]原代肠上皮细胞体外培养为研究肠上皮细胞增殖、分化、凋亡，营养物质吸收利用及转化提供了准确的手段，能够探讨营养物质对肠上皮细胞营养作用机制、重金属及其它有毒有害物质对肠道损伤与肠道修复机制、筛选有益鱼类肠道健康的功能性饲料的理想模型。并且暗纹东方鲀具有最小脊椎动物基因组，却拥有与人相近的基因数目，已作为模式生物应用于基础医学研究领域。但目前河豚肠道上皮细胞培养未突破，已知的公开专利如一种维持鱼类肠细胞增殖分化的原代培养方法(CN201110348822.5)、一种鱼类肠道上皮细胞的分离方法(CN201510893962.9)等不能解决河豚肠道的上皮细胞培养。
[0004]随着我国养殖业的飞速发展，鱼类应激反应问题也愈发严重，大量研究表明，鱼类应激会引发多种疾病，影响养殖业的健康发展。在鱼类养殖过程中，环境变化可能导致鱼类产生氧化应激，而长时间的氧化应激状态下，鱼类体内产生大量活性氧，降低鱼类生长性能，损伤免疫系统，进而引起疾病和死亡。肠黏膜屏障通过肠上皮细胞感受，是机体应激状态下易受到氧化损伤的器官。当前水产动物中没有很好的肠道细胞层面的应激模型，通过肠上皮细胞应激模型的建立能够成为研究鱼类细胞氧化应激损伤机制的有效方法之一。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术的目的在于提供一种暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，为暗纹东方鲀肠道健康的研究提供基础材料，同时为暗纹东方鲀应用于发育生物学、免疫学、毒理与环境检测等方面的研究提供有力的研究材料。
[0006]技术方案：本专利技术的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1、将暗纹东方鲀幼鱼在盐水中养殖7
‑
10d，期间投喂含新霉素和氨苄青霉素饲料，幼鱼取样前禁食；
[0008]步骤2、幼鱼取样麻醉后无菌解剖摘取中段肠道，置于自配的清洗液中，去除肠系膜，纵向剪开肠道，刮去内容物，用自配的清洗液清洗2
‑
3遍，放入无菌离心管中剪成体积为0.5～0.8mm3肠组织块；
[0009]步骤3、向肠组织块中加入0.5～1ml胶原酶Ⅳ消化液，金属浴消化，每隔5～10min取出吹打一次，加入提前配好28℃预温过的完全培养基终止消化，100目筛网过滤后于1000rpm，低温离心后向沉淀中加适量完全培养基，用移液枪反复轻轻吹打混匀，补足完全培养基后进行培养；
[0010]步骤4、培养后吸除培养基，添加含皮质醇的完全培养基刺激肠上皮细胞24h建立氧化应激模型。
[0011]进一步地，步骤1中，所述暗纹东方鲀幼鱼，体长为5
±
0.5cm。
[0012]进一步地，步骤1中，期间投喂的饲料中含新霉素和氨苄青霉素浓度为10～20U/kg和15～20U/kg，两者比例关系为2～4：3～4。
[0013]进一步地，步骤1中，所述盐水浓度为8
‑
10ppt，禁食时间为24
‑
28h。
[0014]进一步地，步骤2中，采用弯头镊子刮去内容物，无菌离心管的容量为1.5ml，所述PBS含1～2％青霉素链霉素，所述自配清洗液的配方如下：
[0015][0016][0017]上述清洗液经微孔滤膜过滤除菌，即得。
[0018]进一步地，步骤3中，所述胶原酶Ⅳ消化液质量浓度为0.25～0.3％；消化条件为28℃金属浴消化25～30min；完全培养基成分为DMEM+胎牛血清+暗纹东方鲀血清，三者比例关系为15～16：2～4：1～2，每100ml培养液中加入400
‑
500μl双抗溶液，双抗溶液包括青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml。
[0019]进一步地，步骤3中，所述低温离心为4℃离心5
‑
6min。
[0020]进一步地，步骤3中，所述培养为28
‑
30℃、4
‑
6％CO2，进行培养72h。
[0021]进一步地，步骤4中，所述皮质醇浓度为80～120nmol/L，能够引起肠上皮细胞氧化应激，且此时的肠上皮细胞密度为1*107以上、存活率为90％以上。
[0022]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：
[0023]1、投喂暗纹东方鲀含有10～20U/kg新霉素和15～20U/kg氨苄青霉素，两者比例关系为2～4：3～4的饲料能有效抑制肠上皮细胞污染，且不会对细胞造成损伤。
[0024]2、采用自配的清洗液对暗纹东方鲀中段肠道进行清洗，可有效去除肠道污染物、
抑制细菌污染，提高细胞存活率。
[0025]3、配制含DMEM+胎牛血清+暗纹东方鲀血清，三者比例关系为15～16：2～4：1～2比例的完全培养基可以为肠上皮细胞提供足够的营养成分，良好适应生长环境，且细胞可快速稳定贴壁。
[0026]4、本专利技术建立了暗纹东方鲀肠上皮细胞应激模型，能够成为研究鱼类肠细胞氧化应激损伤机制的有效材料。
附图说明
[0027]图1：消化处理后暗纹东方鲀原代肠上皮细胞(400
×
)；
[0028]图2：72h培养后暗纹东方鲀原代肠上皮细胞(100
×
)；
[0029]图3：皮质醇处理对暗纹东方鲀原代肠上皮细胞存活及氧化应激的影响(CCK法)；
[0030]图4：原代肠上皮细胞在皮质醇处理下的应激状态(400
×
)；
[0031]图5：原代肠上皮细胞在皮质醇处理下的氧化应激相关基因相对表达量；
[0032]图6：本专利技术实施例得到的原代肠上皮细胞活力数据。
具体实施方式
[0033]下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0034]实施例1
[0035]1、暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、将暗纹东方鲀幼鱼在盐水中养殖7
‑
10d，期间投喂含新霉素和氨苄青霉素饲料，幼鱼取样前禁食；步骤2、幼鱼取样麻醉后无菌解剖摘取中段肠道，置于自配的清洗液中，去除肠系膜，纵向剪开肠道，刮去内容物，用自配的清洗液清洗2
‑
3遍，放入无菌离心管中剪成体积为0.5～0.8mm3肠组织块；步骤3、向肠组织块中加入0.5～1ml胶原酶Ⅳ消化液，金属浴消化，每隔5～10min取出吹打一次，加入提前配好28℃预温过的完全培养基终止消化，100目筛网过滤后于1000rpm，低温离心后向沉淀中加适量完全培养基，用移液枪反复轻轻吹打混匀，补足完全培养基后进行培养；步骤4、培养后吸除培养基，添加含皮质醇的完全培养基刺激肠上皮细胞24h建立氧化应激模型。2.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤1中，所述暗纹东方鲀幼鱼，体长为5
±
0.5cm。3.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤1中，期间投喂的饲料中含新霉素和氨苄青霉素浓度为10～20U/kg和15～20U/kg，两者比例关系为2～4：3～4。4.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤1中，所述盐水浓度为8
‑
10ppt，禁食时间为24

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，马思思，尹绍武，孙亦如，张莹，刘雨曦，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：