一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法技术

本发明专利技术公开了一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法，涉及生物技术领域，可以针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，以断裂点接头序列为切入点，构建置信断裂点筛选模型，揭示扩增子的非线性进化过程和肿瘤耐药克隆进化的全过程，并揭示非同源修复机制介导扩增子的形成，从而为去除肿瘤细胞中DMs的形成或逆转肿瘤耐药提供关键靶点。点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法。

技术介绍

[0002]氨甲蝶呤是恶性肿瘤治疗中的第一个有效的抗代谢药，是目前肿瘤治疗中应用最广泛的叶酸拮抗剂，能竞争性地结合二氢叶酸还原酶，抑制核苷酸代谢，从而阻断DNA的合成，特异性地杀伤增殖期细胞。虽然MTX已成为肿瘤治疗的常用药物，但长时间的用药会导致肿瘤细胞获得耐药性，使治疗效果不佳。DHFR基因扩增，酶水平升高，是导致肿瘤对MTX产生耐药的重要机制。
[0003]位于染色体外的双微体(DMs)是基因扩增的主要遗传学标志及主要载体。癌基因和耐药基因以DMs形式发生扩增会导致基因的表达量增高，进而促进细胞的恶性转化、肿瘤恶性进程及耐药。肿瘤的进展及获得耐药的过程是肿瘤基因组进化的过程，然而在肿瘤获得耐药的过程中，DMs是如何从无到有进化演变的，又是如何驱动肿瘤获得耐药的，目前尚不明确。DMs是由扩增子相互连接环化的而成，并与DNA双链断裂(DSBs)修复密切相关，断裂点处连接序列的特征是推断扩增子形成机制的重要依据，然而DMs扩增子在分子水平的形成机制，目前尚不明确。因此亟需一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法来改变这一现状。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的问题，而提出的一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法，包括以下步骤：
[0007]S1：首先，将人结肠癌细胞系HT29用浓度梯度递增的MTX进行连续培养，待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药后，继续后续实验，HT29亲本及耐药细胞在含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，耐药细胞系培养基中添加相应浓度的MTX，所有细胞均培养在5％二氧化碳、37℃恒温细胞培养箱中；
[0008]S2：取数量不超过5
×
106的生长情况良好的细胞，PBS冲洗3次、胰酶消化并用培养基制备细胞悬液，1000转/分离心5分钟，弃掉上清并用PBS冲洗沉淀，再次离心，弃上清得到细胞沉淀，将细胞沉淀弹开并加入200μl PBS、20μl蛋白酶K和200μl Buffer AL混匀后56℃水浴10分钟，随后加入200μl无水乙醇，涡旋混匀，将液体吸出并加入到QIAmp mini离心柱中，8000转/分离心1分钟后更换收集管，向柱子中加入500μl Buffer AW1离心后更换收集管，条件同上，再加入500μl Buffer AW2,14000转/分全速离心3分钟，将柱子转移至新的1.5ml Eppendorf管中，加适量Buffer AE，室温孵育3分钟后8000转/分离心1分钟，Eppendorf管中离心得到的液体即为基因组DNA，测定DNA浓度并统一配平至50ng/μl；
[0009]S3：联合应用DELLY、LUMPY和CREST共同调取人结肠癌HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系全基因组测序数据中的SV(缺失、重复、倒位、插入、易位)，通过DELLY和LUMPY，分别确定每个样本中所有结构变异的起始位置、终止位置以及支持的对端(pair
‑
ends，PE)读取数和拆分读取(split reads，SR)数。通过CREST，除起始位置和终止位置外，还获得了左/右软剪切读取数(left/right soft
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clipped reads，LeftSclip/RightSclip)，利用每个结构变异断裂点的起始位置，设定具体阈值，将所有样本中断裂点分为高置信、中置信和低置信断裂点；筛选标准及流程为高置信断裂点的筛选标准为由三个软件同步检测到的断裂点或在两个软件中检测到的断裂点(DELLY和LUMPY中的PE&SR，CREST中的LeftSclip&RightSclip必须全部大于或等于10)，中置信断裂点必须由两个软件检测到，PE、SR、LeftSclip、RightSclip中至少有一个大于等于10，但不包括均大于等于10。低置信断裂点同样由两个软件检测到，且PE、SR、LeftSclip、RightSclip均小于10。
[0010]S4：通过以上筛选流程，我们获得了HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的全部高置信、中置信、低置信断裂点集，并将所获得的全部断裂点按照前述5号染色体区域进行划分；
[0011]S5：通过PCR、琼脂糖凝胶电泳及Sanger测序验证DMs区域内全部断裂点、HSRs区域内全部高置信断裂点的准确性；
[0012]S6：分析全基因组测序SV高置信数据中DMs区域内高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的检出情况，获得全基因组测序SV高置信数据中DMs区域内高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的进化情况。同时，通过分析DMs区域内验证成功的高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的Sanger测序情况，获得DMs区域内验证成功的高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的进化情况；
[0013]S7：继续分析全基因组测序SV高置信数据中HSRs区域内高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的检出情况，获得全基因组测序SV高置信数据中HSRs区域内高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的进化情况。同时，分析HSRs区域内验证成功的高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的Sanger测序情况，获得HSRs区域内验证成功的高置信断裂点在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的进化情况的进化情况；将断裂点数据整理为行为断裂点、列为样本的0
‑
1矩阵。其中，“验证成功的DMs区域内高置信断裂点”、“验证成功的HSRs区域内高置信断裂点”、“验证成功的DMs区域及HSRs区域内全部高置信断裂点”的数据直接在excel中转化为0
‑
1矩阵；“全基因组测序SV数据中全部高置信断裂点”的数据，先提取样本和断裂点位置信息，并根据断裂点和样本的对应信息整理为行为断裂点、列为样本的0
‑
1矩阵。将产生的0
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1矩阵进行合并及去除重复断裂点。应用R中的dist函数从细胞系中识别出二进制断裂点，计算每两个样本间的几何距离，得到一个距离矩阵。随后应用R中的hclust函数对该矩阵进行层次聚类，得到最终的树型结构图；
[0014]S8：应用UCSC网页的BLAT在线工具并参照Feb.2009对断裂点接头序列进行全基因组序列的比对，应用NCBI的BLAST工具进行序列的同源性比对。此外，我们通过下载所有的UCSC的基因组重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MTX耐药肿瘤细胞扩增子的进化和形成机制分析方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：首先，将人结肠癌细胞系HT29用浓度梯度递增的MTX进行连续培养，待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药后，继续后续实验，HT29亲本及耐药细胞在含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，耐药细胞系培养基中添加相应浓度的MTX，所有细胞均培养在5％二氧化碳、37℃恒温细胞培养箱中；S2：取数量不超过5
×
106的生长情况良好的细胞，PBS冲洗3次、胰酶消化并用培养基制备细胞悬液，1000转/分离心5分钟，弃掉上清并用PBS冲洗沉淀，再次离心，弃上清得到细胞沉淀，将细胞沉淀弹开并加入200μl PBS、20μl蛋白酶K和200μl Buffer AL混匀后56℃水浴10分钟，随后加入200μl无水乙醇，涡旋混匀，将液体吸出并加入到QIAmp mini离心柱中，8000转/分离心1分钟后更换收集管，向柱子中加入500μl Buffer AW1离心后更换收集管，条件同上，再加入500μl Buffer AW2,14000转/分全速离心3分钟，将柱子转移至新的1.5ml Eppendorf管中，加适量Buffer AE，室温孵育3分钟后8000转/分离心1分钟，Eppendorf管中离心得到的液体即为基因组DNA，测定DNA浓度并统一配平至50ng/μl；S3：联合应用DELLY、LUMPY和CREST共同调取人结肠癌HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系全基因组测序数据中的SV(缺失、重复、倒位、插入、易位)，通过DELLY和LUMPY，分别确定每个样本中所有结构变异的起始位置、终止位置以及支持的对端(pair
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ends，PE)读取数和拆分读取(split reads，SR)数。通过CREST，除起始位置和终止位置外，还获得了左/右软剪切读取数(left/right soft
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clipped reads，LeftSclip/RightSclip)，利用每个结构变异断裂点的起始位置，设定具体阈值，将所有样本中断裂点分为高置信、中置信和低置信断裂点；筛选标准及流程为高置信断裂点的筛选标准为由三个软件同步检测到的断裂点或在两个软件中检测到的断裂点(DELLY和LUMPY中的PE&SR，CREST中的LeftSclip&RightSclip必须全部大于或等于10)，中置信断裂点必须由两个软件检测到，PE、SR、LeftSclip、RightSclip中至少有一个大于等于10，但不包括均大于等于10。低置信断裂点同样由两个软件检测到，且PE、SR、LeftSclip、RightSclip均小于10；S4：通过以上筛选流程，我们获得了HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的全部高置信、中置信、低置信断裂点集，并将所获得的全部断裂点按照前述5号染色体区域进行划分；S5：通过PCR、琼脂糖凝胶电泳及Sanger测序验证DMs区域内全部断裂点、HSRs区域内全部高置信断裂点的准确性；S6：分析全基因组测序SV高置信数据中DMs区域内高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的检出情况，获得全基因组测序SV高置信数据中DMs区域内高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的进化情况。同时，通过分析DMs区域内验证成功的高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的Sanger测序情况，获得DMs区域内验证成功的高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的进化情况；S7：继续分析全基因组测序SV高置信数据中HSRs区域内高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的检出情况，获得全基因组测序SV高置信数据中HSRs区域内高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系中的进化情况。同时，分析HSRs区域内验证成功的高置信断裂点接头序列在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的
Sanger测序情况，获得HSRs区域内验证成功的高置信断裂点在HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的进化情况的进化情况；将断裂点数据整理为行为断裂点、列为样本的0
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1矩阵。其中，“验证成功的DMs区域内高置信断裂点”、“验证成功的HSRs区域内高置信断裂点”、“验证成功的DMs区域及HSRs区域内全部高置信断裂点”的数据直接在excel中转化为0
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1矩阵；“全基因组测序SV数据中全部高置信断裂点”的数据，先提取样本和断裂点位置信息，并根据断裂点和样本的对应信息整理为行为断裂点、列为样本的0
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1矩阵。将产生的0
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1矩阵进行合并及去除重复断裂点。应用R中的dist函数从细胞系中识别出二进制断裂点，计算每两个样本间的几何距离，得到一个距离矩阵。随后应用R中的hclust函数对该矩阵进行层次聚类，得到最终的树型结构图；S8：应用UCSC网页的BLAT在线工具并参照Feb.2009对断裂点接头序列进行全基因组序列的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋盈，孟祥宁，蔡梦迪，肖云，傅松滨，冯犇，王利强，关荣伟，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：