一种重组人透明质酸酶制剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组人透明质酸酶制剂及其应用，所述的重组人透明质酸酶制剂包含；重组人透明质酸酶、缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂，稳定剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠、甲硫氨酸中的一种或多种，可维持重组人透明质酸酶在2～8℃条件下的稳定性。这种重组人透明质酸酶制剂可应用于辅助皮下输液药物的制备。辅助皮下输液药物可使原本只能通过静脉给药的大输液药物，通过皮下输注的方式进行给药，临床使用更方便、安全和舒适。安全和舒适。

A recombinant human hyaluronidase preparation and its application

【技术实现步骤摘要】
一种重组人透明质酸酶制剂及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体地涉及为一种重组人透明质酸酶制剂及其在制备辅助皮下输液药物中的应用。

技术介绍

[0002]透明质酸(hyaluronic acid，HA)又称糖醛酸、玻璃酸或玻尿酸，是由D
‑
葡萄糖醛酸及N
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乙酰葡糖胺两个双糖单位重复连接组成的直链高分子糖胺多聚糖，广泛地存在于脊椎动物的结缔组织、粘液组织、眼球之晶状体及皮肤中，在胚胎、软骨、滑液、玻璃体、脐带、鸡冠等组织中尤为丰富。透明质酸是人体组织基质中分布最广的一种酸性黏多糖，在体内具有多种功能，如构成多种基质、限制水分及其它细胞外物质扩散的作用，调节渗透压，调控大分子物质转运，在细胞周围形成物理屏障等。由于透明质酸在体内通过形成网状屏障填充在胞外基质胶原蛋白纤维骨架之间，限制了药物的皮下扩散，降低药物到达血管的速度，且限制了皮下注射的液体体积。
[0003]透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)，也称玻璃酸酶，是一种能够特异性水解透明质酸、从而提高组织中液体渗透能力的蛋白内切酶，在体内广泛分布于血清、脑和胎盘等组织和体液中。通过断裂葡糖胺的C1和葡萄糖醛酸C4间的葡糖酸键对透明质酸水解，暂时降低细胞间质的粘度，促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散而利于吸收。
[0004]通常市面上可用的透明质酸酶是通过将哺乳动物的睾丸进行盐析然后冻干、或者通过在盐析之后去热原然后冻干而获得。例如，以下材料可以用作纯化方法的原材料：盐析一次然后冻干的哺乳动物的睾丸材料、盐析两次然后冻干的睾丸材料，或盐析两次、去热原然后冻干的睾丸材料。现有的透明质酸酶通过从绵羊睾丸两次盐析、冻干、透析、去热原、然后冷冻干燥来提取，并且提取的物质掺混大量的透明质酸酶之外的蛋白质。市面上可用的粗品状态的冻干透明质酸酶包含大量的杂质，纯度低，制备成液体制剂时稳定性差。
[0005]静脉输液是指将大量无菌液体、电解质、药物由静脉输入体内的方法。尽管可以快速、直接的对患者进行给药使药物达到治疗浓度，静脉输液存在较明显的不良反应。静脉输液的不良反应主要包括药物不良反应、晕针反应、静脉炎、循环负荷过重、空气栓塞、感染等，给患者增加痛苦并对治疗造成阻碍，严重的输液不良反应甚至可能危及生命。据不完全统计，我国每年输液量超百亿瓶，每年约20万人死于输液不良反应。国际上平均每人输液2.5
‑
3.3瓶/年，我国则是8瓶。自2015年起，为了降低静脉输液的治疗事故的发生，多个省份陆续出台了关于限制和规范静脉输液的治疗的规定。
[0006]因此，为了方便临床使用、降低风险，亟需一种安全、有效、舒适的输液方式取代传统的静脉输液。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是为了克服现有技术的缺陷，提供一种重组人透明质酸酶制剂在制备皮下输液药品中的应用，该制剂临床使用方便，用途广泛，制剂配方简单，产
品稳定性良好，刺激性低，安全，有效。可解决临床治疗时，难以通过皮下给药途径进行大体积输液而必须通过静脉进行输液的问题。本专利技术在进行重组人透明质酸酶辅助药物皮下输液的动物实验时，意外的发现，通过与透明质酸酶组合使用，药液在被注射入小型猪皮下后能够快速的扩散和吸收，与阴性对照组(不与透明质酸酶组合用药，直接皮下输注药液)相比，实验组能够显著降低药液在皮下的输注压力，降低输注后皮肤肿胀变形程度及恢复正常所需的时间，输注部位无明显红肿，辅助输注的药液的快速扩散和吸收，使大体积药液的皮下给药成为可能。
[0008]本专利技术通过以下技术方案解决以上技术问题：
[0009]1.透明质酸酶制剂及应用
[0010]本专利技术的第一方面涉及一种重组人透明质酸酶制剂，所述制剂包含：重组人透明质酸酶、缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂，其中：
[0011]重组人透明质酸酶的酶活性为45单位/ml～4500000单位/ml；
[0012]所述的缓冲剂的浓度为5～50mM；
[0013]所述的稳定剂的浓度为1～500mM，所述的稳定剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠、甲硫氨酸中的一种或多种；
[0014]所述的非离子型表面活性剂的浓度为0.01％～0.1％(w/v)；
[0015]所述的制剂的pH为5.5～8.0。
[0016]所述的重组人透明质酸酶的酶活性优选为45单位/ml～3000000单位/ml；更优选为45单位/ml～1500000单位/ml；再优选为45单位/ml～300000单位/ml，例如45单位/ml、100单位/ml、150单位/ml、500单位/ml、1000单位/ml、5000单位/ml、50000单位/ml、300000单位/ml、1500000单位/ml、3000000单位/ml或4500000单位/ml。
[0017]所述的重组人透明质酸酶的浓度优选为0.15～0.75μg/ml、0.75～2.5μg/ml、2.5～5μg/ml、5.5～25μg/ml、25μg/ml～0.3mg/ml、0.3～1.5mg/ml、1.5～7.5mg/ml、7.5～15mg/ml或15～22.5mg/ml，例如0.15μg/ml、0.33μg/ml、0.5μg/ml、1.7μg/ml、3.3μg/ml、17μg/ml、0.2mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml或15mg/ml。
[0018]所述的重组人透明质酸酶的酶活性还可为300000单位/ml～1500000单位/ml、1500000单位/ml～3000000单位/ml或300000单位/ml～450000单位/ml。
[0019]优选地，所述的缓冲剂提供的pH为5.5～8.0，例如5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。
[0020]所述的缓冲剂可为本领域常规，优选为组氨酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、Tris缓冲剂中的一种或多种，例如组氨酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸缓冲剂或Tris缓冲剂。
[0021]其中，所述的组氨酸缓冲剂提供的pH为5.5～7.5，所述的醋酸缓冲剂提供的pH为5.0～6.0，所述的磷酸盐缓冲剂提供的pH为6.0～8.0，所述的柠檬酸缓冲剂提供的pH为5.0～7.0，所述的Tris缓冲剂提供的pH为7.0～8.0。
[0022]优选地，所述的组氨酸缓冲剂的pH为6.0。
[0023]优选地，所述的醋酸缓冲剂的pH为5.0。
[0024]优选地，所述的磷酸盐缓冲剂的pH为7.0。
[0025]优选地，所述的柠檬酸缓冲剂的pH为6.5。
[0026]优选地，所述的Tris缓冲剂的pH为8.0。
[0027]优选地，所述的组氨酸缓冲剂浓度为5～50mM，例如5mM、10mM或50mM。
[0028]优选地，所述的醋酸缓冲剂浓度为5～50mM，例如5mM、10mM或50mM。
[0029]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人透明质酸酶制剂，其特征在于，所述重组人透明质酸酶制剂包含：重组人透明质酸酶、缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂：重组人透明质酸酶的酶活性为45单位/ml～4500000单位/ml；所述的缓冲剂的浓度为5～50mM；所述的稳定剂的浓度为1～500mM，所述的稳定剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠、甲硫氨酸中的一种或多种；所述的非离子型表面活性剂的浓度为0.01％～0.1％(w/v)；所述的制剂的pH为5.0～8.0。2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的重组人透明质酸酶的酶活性为45单位/ml～3000000单位/ml，优选45单位/ml～1500000单位/ml，更优选45单位/ml～300000单位/ml；和/或，所述的重组人透明质酸酶包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；较佳地，所述的重组人透明质酸酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；和/或，所述的稳定剂的浓度为100～400mM；较佳地为150～350mM，例如，155mM、188mM、193mM、215mM、233mM、240mM、263mM、283mM、292mM、316mM或者330mM。3.如权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述海藻糖或者蔗糖的浓度为10～250mM，优选为25mM～200mM，例如25mM～130mM；和/或，所述氯化钠的浓度为30～250mM，优选为50mM～170mM，例如50mM、90mM、130mM、145mM或170mM；和/或，所述的甲硫氨酸浓度为5～50mM，优选为5mM、10mM或50mM；和/或，所述的甘露醇的浓度为150～300mM，例如165mM、220mM或280mM。4.如权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述稳定剂的浓度为185～380mM，且至少包含甘露醇和甲硫氨酸，以及海藻糖或蔗糖；其中，所述甘露醇的浓度为150～280mM，所述甲硫氨酸的浓度为5～50mM，所述海藻糖或蔗糖的浓度为25～130mM；和/或，所述的重组人透明质酸酶的酶活性为150单位/ml～4500000单位/ml。5.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的缓冲剂为组氨酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、Tris缓冲剂中的一种或多种；例如，所述缓冲剂为组氨酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸缓冲剂或者Tris缓冲剂；和/或，所述的非离子型表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188中的一种或多种；其中：所述的醋酸缓冲剂浓度优选为5～50mM，例如5mM、10mM或50mM；所述的磷酸盐缓冲剂浓度优选为5～50mM，例如5mM、10mM或50mM；所述的柠檬酸缓冲剂浓度优选为5～50mM，例如5mM、10mM或50mM；所述的Tris缓冲剂浓度优选为5～50mM，例如5mM、10mM或50mM；所述的非离子型表面活性剂的浓度优选为0.02％(w/v)。6.如权利要求1～5任一项所述的制剂，其特征在于，所述的重组人透明质酸酶制剂的稳定剂为以下组成之一：(1)145mM氯化钠和10mM甲硫氨酸；(2)130mM氯化钠、53mM海藻糖和10mM甲硫氨酸；
(3)130mM氯化钠、53mM蔗糖和10mM甲硫氨酸；(4)26mM海藻糖、280mM甘露醇和10mM甲硫氨酸；(5)30mM氯化钠、200mM海藻糖和10mM甲硫氨酸；(6)180mM氯化钠、25mM海藻糖和10mM甲硫氨酸；(7)30mM氯化钠、200mM蔗糖和10mM甲硫氨酸；(8)180mM氯化钠、25mM蔗糖和10mM甲硫氨酸；(9)130mM氯化钠、53mM海藻糖和5mM甲硫氨酸；(10)130mM氯化钠、53mM海藻糖和50mM甲硫氨酸；(11)130mM氯化钠、53mM海藻糖和10mM甲硫氨酸；(12)22mM甘露醇、53mM海藻糖和10mM甲硫氨酸；(13)53mM海藻糖、220mM甘露醇和10mM甲硫氨酸；(14)53mM海藻糖、220mM甘露醇和5mM甲硫氨酸；(15)53mM海藻糖、220mM甘露醇和50mM甲硫氨酸；(16)150mM甘露醇、170mM氯化钠和10mM甲硫氨酸；(17)220mM甘露醇、53mM海藻糖和10mM甲硫氨酸；(18)150mM甘露醇、50mM氯化钠、53mM海藻糖和10mM甲硫氨酸；(19)150mM甘露醇、90mM氯化钠、130mM海藻糖和10mM甲硫氨酸；(20)150mM甘露醇、25mM海藻糖和10mM甲硫氨酸；(21)220mM甘露醇、53mM蔗糖和10mM甲硫氨酸；(22)150mM甘露醇、50mM氯化钠、53mM蔗糖和10mM甲硫氨酸；(23)150mM甘露醇、90mM氯化钠、130mM蔗糖和10mM甲硫氨酸；(24)150mM甘露醇、25mM蔗糖和10mM甲硫氨酸；(25)132mM海藻糖、150mM甘露醇和10mM甲硫氨酸。7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述的重组人透明质酸酶制剂为以下组成之一：(1)5000单位/ml重组人透明质酸酶、5mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(2)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(3)5000单位/ml重组人透明质酸酶、50mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(4)5000单位/ml重组人透明质酸酶、5mM组氨酸缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为6.0；(5)5000单位/ml重组人透明质酸酶、50mM组氨酸缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为6.0；(6)5000单位/ml重组人透明质酸酶、5mM醋酸缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为5.0；(7)5000单位/ml重组人透明质酸酶、50mM醋酸缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为5.0；
(8)5000单位/ml重组人透明质酸酶、5mM柠檬酸缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为6.5；(9)5000单位/ml重组人透明质酸酶、50mM柠檬酸缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为6.5；(10)5000单位/ml重组人透明质酸酶、5mM Tris缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为8.0；(11)5000单位/ml重组人透明质酸酶、50mM Tris缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为8.0；(12)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、5mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(13)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、50mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(14)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、200mM海藻糖、30mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(15)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)泊洛沙姆188，pH为7.0；(16)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、25mM海藻糖、180mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(17)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、200mM蔗糖、30mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(18)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM蔗糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(19)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、25mM蔗糖、180mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(20)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02％(w/v)聚山梨酯80，pH为7.0；(21)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.01％(w/v)聚山梨酯80，pH为7.0；(22)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.10％(w/v)聚山梨酯80，pH为7.0；(23)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.01％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(24)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.10％(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(25)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.01％(w/v)泊洛沙姆188，pH为7.0；(26)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.10％(w/v)泊洛沙姆188，pH为7.0；(27)500单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、
10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(28)45单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(29)150单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(30)1000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(31)50000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(32)300000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(33)1500000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(34)3000000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(35)4500000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、130mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(36)4500000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、145mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(37)1500000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、145mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(38)300000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、145mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(39)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、145mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(40)150单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、145mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(41)45单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、145mM氯化钠、10mM甲硫氨酸以及0.02(w/v)聚山梨酯20，pH为7.0；(42)45单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、22mM甘露醇、53mM海藻糖、10mM甲硫氨酸以及0.02％聚山梨酯20，pH为7.0；(43)500单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、22mM甘露醇、53mM海藻糖、10mM甲硫氨酸以及0.02％聚山梨酯20，pH为7.0；(44)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、22mM甘露醇、53mM海藻糖、10mM甲硫氨酸以及0.02％聚山梨酯20，pH为7.0；(45)50000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、22mM甘露醇、53mM海藻糖、10mM甲硫氨酸以及0.02％聚山梨酯20，pH为7.0；(46)300000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、22mM甘露醇、53mM海藻糖、10mM甲硫氨酸以及0.02％聚山梨酯20，pH为7.0；
(47)4500000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、22mM甘露醇、53mM海藻糖、10mM甲硫氨酸以及0.02％聚山梨酯20，pH为7.0；(48)5000单位/ml重组人透明质酸酶、5mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、220mM甘露醇、10mM甲硫氨酸以及0.02％聚山梨酯20，pH为7.0；(49)5000单位/ml重组人透明质酸酶、10mM磷酸盐缓冲剂、53mM海藻糖、220mM甘露醇、10mM甲硫氨酸以及0.02％聚山梨酯20，pH为7.0；(50)5000单位/ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：王征，刘彦君，
申请(专利权)人：上海宝济药业有限公司，
类型：发明
国别省市：