基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法，包括以下步骤：将至少两种具有不同分子量的蛋白质混合均匀制得蛋白质样本，向蛋白质样本中依次加入蛋白质还原反应溶液，蛋白质还原剂，并混合搅拌均匀，备用；向还原后的蛋白质样本溶液中加入丙烯酰胺标记半胱氨酸，然后再加入丁二酸酐标记赖氨酸；将双氨基酸标记的蛋白质溶液通过脱盐柱除去未反应的试剂；酶解，对酶解产物进行色谱

Stable isotope labeling method of double amino acids based on first-order mass spectrometry and its application

【技术实现步骤摘要】
基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法及应用


[0001]本专利技术属于同位素标记方法
，具体涉及一种基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法。

技术介绍

[0002]稳定同位素标记技术结合质谱检测已成为一种复杂生物样本中蛋白质的定量分析方法。现有的稳定同位素标记技术主要是通过对蛋白质或蛋白质酶解产物(即肽段)中特定氨基酸(例如，赖氨酸)的标记，然后对蛋白质酶解产物肽段分子进行数据依赖性(data dependent acquisition,DDA)质谱分析，即在一级质谱(MS)分析中选择某种质荷比(m/z)的母离子肽段分子(例如，m/z 537.827，+2)经过一定质量范围(例如，
±
0.6Da)的离子隔离窗口(isolation window)进入充有高纯(>99.999％)惰性气体的高能量碰撞室而发生离子碎片化(fragmentation)，获得二级质谱(MS/MS)分析图谱(即子离子图谱)。通过对二级质谱中带有同位素标记的子离子或报告离子(reporter ions)检测而达到对蛋白质定量分析目的。例如，Thermo Scientific公司研发的TMT(tandem mass tag，TMT)和AB SCIEX公司研发的iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)标记技术。这两种标记技术均通过测定二级质谱中同位素标记的报告离子峰面积实现对多种不同样品中蛋白质的定量分析。
[0003]然而，这些定量分析技术的主要问题是：
[0004]①
一级质谱中(MS)除了被选择的母离子肽段分子外，离子隔离窗口(isolation window)内(例如，
±
0.6Da)的其它肽段母离子也被同时选择并发生二级质谱分析，因此对二级质谱报告离子的准确检测产生无法克服的干扰。
[0005]②
一级质谱分析中选择的位于离子隔离窗口(isolation window)内的两种或两种以上肽段母离子混合物在二级质谱中所产生的报告离子峰面积来自这些肽段母离子各自报告离子峰面积的叠加，无法准确测定一级质谱中指定母离子的报告离子峰面积，也就无法对该母离子肽段所代表的蛋白质进行准确的定量分析。
[0006]随着高分辨质谱的广泛应用，基于一级质谱分析的稳定同位素标记技术可以获得较为准确的定量分析结果。然而，现有技术由于一次只能标记一种氨基酸(例如，半胱氨酸)而导致产生有限的可定量分析的肽段母离子，所以极大限制了该技术的广泛应用。因此，开发一种可以同时标记一种以上氨基酸的稳定同位素标记技术对提高定量分析效率意义重大。

技术实现思路

[0007]本申请的主要目的在于提供一种通过对两种不同的氨基酸进行稳定同位素标记而提高蛋白质定量分析产率和效率的基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一种基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法，包括以下步骤：
[0010](1)将至少两种具有不同分子量的蛋白质混合均匀制得蛋白质样本，向蛋白质样本中依次加入蛋白质还原反应溶液，蛋白质还原剂，并混合搅拌均匀，备用；
[0011](2)向步骤(1)所得还原后的蛋白质样本溶液中加入丙烯酰胺标记半胱氨酸，然后再加入丁二酸酐标记赖氨酸；
[0012](3)将步骤(2)所得双氨基酸标记的蛋白质溶液通过脱盐柱除去未反应的试剂；
[0013](4)向步骤(3)所得双氨基酸标记的蛋白质样本中加入胰蛋白酶
‑
Trypsin进行酶解；对酶解产物进行色谱
‑
质谱分析。
[0014]上述一种基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述蛋白质还原反应溶液为含4M尿素、20mM Tris
‑
HCl、3％异丙醇的水溶液；蛋白质样本与蛋白质还原反应溶液的用量比为1mg：1ml。
[0015]上述一种基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述蛋白质还原剂为含500mM TCEP水溶液，蛋白质样本与蛋白质还原剂的用量比为1mg：50ul；混合搅拌的温度为37℃，混合搅拌的时间为30min。
[0016]TCEP为三(2
‑
羧乙基)膦，是一种非常有效的硫醇类还原剂，广泛用作蛋白质化学及蛋白质组学研究中二硫键的定量还原剂。该试剂在水溶液中的稳定性和溶解性都很好。在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错。与其他类别的硫醇类还原剂如DTT相比，TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉。TCEP将蛋白质中由半胱氨酸之间所形成的分子内或分子间二硫键打开形成
‑
SH方可与丙烯酰胺发生丙烯酰化标记反应。
[0017]上述一种基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法，作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，所加丙烯酰胺的量为蛋白质样本的5
‑
7倍，标记半胱氨酸为：将还原后的蛋白质样本溶液和丙烯酰胺混合均匀，在20
‑
25℃的条件下，避光反应30min；
[0018]所加丁二酸酐的量为蛋白质样本的7
‑
10倍，标记赖氨酸为：加入丁二酸酐混合均匀，在20
‑
25℃的条件下，避光反应30min。
[0019]丙烯酰胺(C3H5ON)与还原后的蛋白质肽链中的半胱氨酸侧链上的巯基(
‑
SH)发生共价反应形成丙烯酰化基团，即每个半胱氨酸侧链上的巯基(
‑
SH)结合上71.0366Da的丙烯酰胺基团(S
‑
C3H4ON)。
[0020]丁二酸酐(C4H4O3)与蛋白质肽链中的赖氨酸侧链上的一级胺(
‑
NH2)发生共价反应形成琥珀酰化基团，即每个赖氨酸侧链上的一级胺(
‑
NH2)结合上100.0160Da的琥珀酰胺基团(NH
‑
C4H4O3)。
[0021]上述一种基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，通过脱盐柱的置换溶液为50mM NH4HCO3。所述脱盐柱(Zeba Spin DesaltingColumns,ThermoScientific)除去剩余的未反应掉的标记试剂丙烯酰胺、丁二酸酐和TCEP。
[0022]上述一种基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法，作为一种优选的实施方案，步骤(4)中，所述酶解为37℃下，酶解反应5h，然后加入甲酸终止酶解反应。
[0023]本申请的第二方面，提供一种基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法在血清定量蛋白质组学分析中的应用。
[0024]本专利技术的有益效果为：本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将至少两种具有不同分子量的蛋白质混合均匀制得蛋白质样本，向蛋白质样本中依次加入蛋白质还原反应溶液，蛋白质还原剂，并混合搅拌均匀，备用；(2)向步骤(1)所得还原后的蛋白质样本溶液中加入丙烯酰胺标记半胱氨酸，然后再加入丁二酸酐标记赖氨酸；(3)将步骤(2)所得双氨基酸标记的蛋白质溶液通过脱盐柱除去未反应的试剂；(4)向步骤(3)所得双氨基酸标记的蛋白质样本中加入胰蛋白酶
‑
Trypsin进行酶解；对酶解产物进行色谱
‑
质谱分析。2.根据权利要求1所述的基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法，其特征在于，步骤(1)中，所述蛋白质还原反应溶液为含4M尿素、20mM Tris
‑
HCl、3％异丙醇的水溶液；蛋白质样本与蛋白质还原反应溶液的用量比为1mg：1ml。3.根据权利要求1所述的基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法，其特征在于，步骤(1)中，所述蛋白质还原剂为含500mM TCEP水溶液，蛋白质样本与蛋白质还原剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：高俊顺，高俊莉，王洪，凌欢君，宋林珍，江南，
申请(专利权)人：杭州广科安德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：