一种鉴定极低需冷量桃种质资源的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定极低需冷量桃种质资源的方法，根据桃花芽中脱落酸(ABA)含量在解除休眠前保持较高水平，在解除休眠后急剧下降的情况，本发明专利技术主要是在冬季大量落叶期前后15d采用测定花芽中脱落酸含量的方法鉴定区分极低需冷量(<300h)桃种质资源。极低需冷量(<300h)桃种质资源。极低需冷量(<300h)桃种质资源。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定极低需冷量桃种质资源的方法


[0001]本专利技术属于植物育种
，具体涉及一种鉴定极低需冷量桃种质资源的方法。

技术介绍

[0002]桃(Prunus persica L.)是蔷薇科(Rosaceae)、李属(Prunus L.)、桃亚属(Amygdalus L.)的多年生中型乔木。原产于我国陕西、甘肃、西藏等西部冷凉地区，需要一定的需冷量完成休眠才能进入雌雄性细胞分化阶段。需冷量是指打破落叶果树自然休眠所需的有效低温时数，一般以气温≤7.2℃为计算起点。当桃树需冷量不能满足时，萌芽不整齐且花期长，花而不实，产量得不到保证。因此，需冷量是南方桃种植成功与否的关键因素之一。目前，按需冷量高低来分类，桃可分为极低需冷量(<300h)、低需冷量(300
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600h)、中需冷量(600
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900h)、高需冷量(900
‑
1200h)、极高需冷量(>1200h)5个等级。
[0003]目前已有相关的研究，例如中国专利申请号201410264421.5公开了快速测定桃需冷量的方法，在桃落叶后，每隔4
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5天采桃当年生枝条3
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5枝，枝条长20
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30cm，每个桃品种枝条上花芽叶芽各不少于20个，枝条在室内插入水中2
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3cm，每隔3天剪一次桃枝条下部露出新茬，每隔三天换水清洁处理一次，室内温度白天23
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25℃，晚上15
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17℃，时间为白/黑＝14/10h，湿度60
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70％，枝条光照强度2500LX，以叶芽露顶50％和花芽顶部绽开50％代表其花芽和叶芽满足其自身需冷量；再辅以需冷量模型来统计需冷量，进而测定出桃的需冷量。
[0004]又例如中国专利申请号202111261417.X公开了一种基于qRT
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PCR检测方法快速测算桃品种需冷量的方法，步骤如下：(一)PpDAM5基因相对表达量的检测；(二)PpDAM5基因相对表达量与需冷量的等级划分；(三)待测桃品种快速测算；该方法以已确定需冷量品种作为标准物，选取桃品种落叶时叶片进行PpDAM5基因表达量测定，建立需冷等级划分模型，将需冷量待测桃新品种进行PpDAM5基因相对表达量检测，然后根据建立的需冷量等级划分模型进行匹配，可以初步快速测算待测桃品种需冷量。
[0005]总的来说，桃需冷量的测定方法主要有以下几种：
[0006](1)水培法：冬季落叶后每隔3
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5d剪取当年生枝条10
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20根插入深2
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3cm水中，放置于人工气候箱，21d后统计萌芽率，当萌芽率超过50％时表示需冷量得到满足，同时统计期间气温低于7.2℃的小时数即为该品种的需冷量；
[0007](2)对照品种法：利用一系列对照品种测定待测品种的需冷量，在国外普遍应用，从田间每隔7d同时采样待测桃品种和对照桃品种(方法同水培法)，在温室中21d后，比较所测定品种与对照品种萌芽率，则可知测定品种的需冷量；
[0008](3)分子标记鉴定：2019年，中国农业科学院郑州果树研究所桃课题组采用分子标记技术鉴定。
[0009]上述方法的缺陷是：一是在人工气候条件下进行测定，枝条剪下后处于离体状态，无法完全模拟田间自然条件，营养物质运输与萌芽均受到一定影响，从而导致测定结果误差较大；二是工作量大，效率低；三是采用分子标记技术只能鉴定区分500h以上的桃种质资
源，500h以下品种无法区分。

技术实现思路

[0010]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了一种鉴定极低需冷量桃种质资源的方法，根据桃花芽中脱落酸含量在大量落叶期保持稳定水平，本专利技术主要通过测定大量落叶期桃花芽中脱落酸含量鉴定区分极低需冷量(<300h)桃种质资源。
[0011]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0012]一种鉴定极低需冷量桃种质资源的方法，包括如下步骤：
[0013]1)选取生长健康的不同需冷量桃种质资源；
[0014]2)采样：分别于落叶前期、大量落叶期、落叶后10天，采集树冠中上部健壮一年生中果枝花芽5.0g，置于液氮中速冻，
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80℃冰箱保存备用；
[0015]3)绘制脱落酸工作曲线：称取脱落酸标准品4.0mg，分别用甲醇定容于100.0mL容量瓶中，作为母液(浓度为0.04mg/mL)，分别取2.0mL、2.5mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL母液置于10mL容量瓶，用甲醇稀释成不同浓度梯度的溶液，用0.22um有机过滤膜过滤，利用高效液相色谱仪测定不同浓度脱落酸峰面积，根据脱落酸峰面积与浓度绘制工作曲线；
[0016]4)脱落酸的提取：将步骤2)收集的新鲜花芽，液氮速冻后用冷冻干燥机干燥至恒重，充分研磨粉碎，准确称取100.0mg置于2.5mL离心管，加入提取液(甲醇:水:甲酸＝80:20:0.2)1.5mL，摇床中震荡提取40min，离心8min(14000r/min，4℃)，离心后吸取上层液置于新的5mL离心管，同样提取方法提取2次后合并提取液，氮吹仪挥干溶剂，加入1mL 50％甲醇水溶液复溶，用0.22um有机过滤膜过滤后上机分析；
[0017]5)脱落酸含量测定：采用高效液相色谱仪测定花芽中脱落酸含量，条件：
[0018]色谱柱：YMC
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Pack ODS
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AM(150
×
4.6mm，3μm)；柱温：30.0℃；检测波长265nm；
[0019]流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；流速：0.5mL/min；进样量10.0μL；
[0020]时间梯度：0.00
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33.00min：40％B、33.01
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34.00min：100％B、34.01
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46.00min：100％B、46.01
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47.00min：40％B、47.01
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60.00min：40％B；
[0021]6)当未知需冷量桃种质资源干燥花芽中脱落酸含量小于14.00μg/g，鉴定为极低需冷量桃种质资源(需冷量<300h)。
[0022]本专利技术中：
[0023]步骤1)所述的不同需冷量桃种质资源，选自热带王子(150h)、南山甜桃(200h)、Flordaglo(200h)、玛丽维拉(250h)、Sunraycer(300h)、早红2号(500h)、中油13号(550h)、双佛(550h)、美婷(550h)、五月火(550h)、阿姆肯(600h)、春美(600h)、锦春(600h)、锦花(800h)、美锦(800h)。
[0024]步骤3)所述的高效液相色谱仪，选自岛津LC
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定极低需冷量桃种质资源的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)选取生长健康的不同需冷量桃种质资源；2)采样：在冬季大量落叶期前后15d，采集树冠中上部健壮一年生中果枝花芽5.0g，置于液氮中速冻，
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80℃冰箱保存备用；3)绘制脱落酸工作曲线：称取脱落酸标准品4.0mg，分别用甲醇定容于100.0mL容量瓶中，作为母液，浓度为0.04mg/mL，分别取2.0mL、2.5mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL母液置于10mL容量瓶，用甲醇稀释成不同浓度梯度的溶液，用0.22um有机过滤膜过滤，利用高效液相色谱仪测定不同浓度脱落酸峰面积，根据脱落酸峰面积与浓度绘制工作曲线；4)脱落酸的提取：将步骤2)收集的新鲜花芽，液氮速冻后用冷冻干燥机干燥至恒重，充分研磨粉碎，准确称取100.0mg置于2.5mL离心管，加入提取液，甲醇:水:甲酸＝80:20:0.2，1.5mL，摇床中震荡提取40min，离心8min，14000r/min，4℃，离心后吸取上层液置于新的5mL离心管，同样提取方法提取2次后合并提取液，氮吹仪挥干溶剂，加入1mL 50％甲醇水溶液复溶，用0.22um有机过滤膜过滤后上机分析；5)脱落酸含量测定：采用高效液相色谱仪测定花芽中脱落酸含量，条件：色谱柱：YMC
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Pack ODS
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AM，150
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4.6mm，3μm；柱温：30.0℃；检...

【专利技术属性】
技术研发人员：万保雄，陆泰良，李海炎，朱鹏翔，梁瑞郑，阳爱民，李怡杰，
申请(专利权)人：广西特色作物研究院，
类型：发明
国别省市：