基于GC-MS或GC-MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于GC

【技术实现步骤摘要】
基于GC
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MS或GC
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MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法


[0001]本专利技术属于气质联用检测短链脂肪酸
，特别是基于GC
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MS或 GC
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MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法。

技术介绍

[0002]短链脂肪酸(SCFAs)是结肠上皮细胞重要的能量来源，作为配体能够激活特异性蛋白偶联受体，调节上皮细胞的增殖和分化；对炎症性肠病、结直肠癌、2
‑ꢀ
型糖尿病、肥胖和心血管疾病具有明显的保护作用。技术人员发现，粪便等肠道微生物群中短链脂肪酸含量较高，可以通过采集生物粪便样本，利用气相色谱
‑ꢀ
质谱联用等技术进行短链脂肪酸检测。
[0003]现有技术中，中国专利申请CN105651908A提供了一种基于GC
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MS定量肠道内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸的方法，以小鼠肠道内容物及粪便为样本，通过冻干，乙酸乙酯萃取，加入衍生化试剂MTBSTFA进行衍生化处理，最后使用GC
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MS技术得到质谱图，与NIST、WILY等谱库提供的质谱图对照，对样本中化合物进行定性分析；以11种短链脂肪酸特征离子峰的峰面积与相应的内标特征离子峰m/z 116的峰面积之比为纵坐标y，短链脂肪酸浓度为横坐标 x绘制曲线，得到样本中11种短链脂肪酸定量检测的结果。中国专利申请 CN111239267A提供了一种基于GC
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MS检测血清、淋巴组织中短链脂肪酸的方法，将淋巴组织研磨离心得到淋巴提取液，加入内标物，再加入五氟溴卞衍生化反应；使用正己烷萃取后利用GC
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MS对萃取液中的乙酸、丙酸和丁酸进行检测。这2篇专利中采用衍生化方式提取SCFAs，前处理繁琐，耗时长。
[0004]中国专利申请CN112014491A提供了一种短链脂肪酸的检测方法，配制不同浓度的短链脂肪酸标准品混合液，加入内标，采用气相色谱
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质谱联用仪测试，求出线性回归方程；往测试样本中加入酸液及含内标的甲基叔丁基醚提取液进行提取，得到分离液，利用气相色谱
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质谱联用仪测试所述分离液；将测试结果代入线性回归方程计算测试样品的短链脂肪酸含量。然而，该技术采用甲基叔丁基醚作为萃取剂，一是甲基叔丁基醚毒性较大，对于大批量样本前处理，对实验人员不友好；二是单独使用甲基叔丁基醚，能得到的色谱峰型一般，检测灵敏度也一般。

技术实现思路

[0005]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了基于GC
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MS或GC
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MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，采用甲基叔丁基醚和正己烷两步萃取法直接提取SCFAs并结合GC
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MS进行检测，前处理简单，耗时短，提取更充分，回收率高；相比于单独使用甲基叔丁基醚提取SCFAs，更加安全可靠；采用正己烷复溶，更有利于保护色谱柱和质谱仪器。具体通过以下技术实现。
[0006]基于GC
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MS或GC
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MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，包括
以下步骤：
[0007]S1、配制不同浓度的含有11种短链脂肪酸的混合标准工作液，加入酸液和内标，进行GC
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MS或GC
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MS/MS检测，以11种短链脂肪酸的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，短链脂肪酸的浓度为横坐标，获得相应的线性回归方程；
[0008]S2、取人或动物的粪便、血浆或尿液样本，加入酸液进行预处理；然后加入第一萃取液，涡旋、振荡；再加入第二萃取液，涡旋、振荡；再加入内标，在冰上涡旋振荡，冰水浴中超声处理，离心取上清液；所述第一萃取液为体积比1:1 的甲基叔丁基醚、正己烷混合液，所述第二萃取液为正己烷；
[0009]S3、取步骤S2的上清液进行GC
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MS或GC
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MS/MS检测，与步骤S1中相应的线性回归方程进行比对，获得11种短链脂肪酸的含量。
[0010]优选地，11种短链脂肪酸分别为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、甲基戊酸、己酸、2
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甲基己酸、正庚酸和正辛酸。
[0011]更优选地，使用GC
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MS检测时，步骤S1中，不同浓度的含有11种短链脂肪酸混合标准工作液的配制方法为：
[0012]分别移取11种短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、 4
‑
甲基戊酸、己酸、2
‑
甲基己酸、正庚酸、正辛酸)的标准品，用第一萃取液分别配制成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00mM的含11种短链脂肪酸的混合标准工作液；
[0013]使用GC
‑
MS/MS检测时，步骤S1中不同浓度的含有11种短链脂肪酸混合标准工作液的配制方法为：分别移取11种短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、4
‑
甲基戊酸、己酸、2
‑
甲基己酸、正庚酸、正辛酸)的标准品，用第一萃取液分别配制成0.01、0.05、0.20、1.00、5.00、10.00μM的含 11种短链脂肪酸的混合标准工作液。
[0014]更优选地，步骤S1中，分别取不同浓度的含有11种短链脂肪酸的混合标准工作液200μL，分别加入10μL的5M的酸液和50μL的0.5mM的内标进行GC
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MS 检测，或者分别加入10μL的5M的酸液和50μL的50μM的内标进行GC
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MS/MS 检测。
[0015]优选地，步骤S2具体为：取30
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50mg固体样本或30
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50μL液体样本，加入 10μL 5M的酸液，然后加入100μL第一萃取液，涡旋、振荡；再加入100μL第二萃取液，涡旋、振荡；再加入50μL内标，6500rpm冰上涡旋振荡10min，冰水浴中超声处理10min；最后4℃、12000rpm离心10min，
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20℃静置30min。
[0016]更优选地，步骤S2中，涡旋、振荡的转速为5000
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7000rpm，时间为5
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10min。
[0017]优选地，步骤S3中，气相色谱分析条件为：采用毛细管色谱柱HP
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INNOWAX 分离，规格为30m
×
0.25mm
×
0.25μm；进样口温度260℃，进样量1μL，分流比 10:1；载气：氦气，柱流量1mL/min；色谱柱初始温度50℃，以5℃/min速率升温至150℃，再以10℃/min升温至250℃，保持2min；
[0018]使用GC
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MS检测时，质谱条件为：采用单四级本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于GC
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MS或GC
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MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、配制不同浓度的含有11种短链脂肪酸的混合标准工作液，加入酸液和内标，进行GC
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MS或GC
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MS/MS检测，以11种短链脂肪酸的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，短链脂肪酸的浓度为横坐标，获得相应的线性回归方程；S2、取人或动物的粪便、血浆或尿液样本，加入酸液进行预处理；然后加入第一萃取液，涡旋、振荡；再加入第二萃取液，涡旋、振荡；再加入内标，在冰上涡旋振荡，冰水浴中超声处理，离心取上清液；所述第一萃取液为体积比1:1的甲基叔丁基醚、正己烷混合液，所述第二萃取液为正己烷；S3、取步骤S2的上清液进行GC
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MS或GC
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MS/MS检测，与步骤S1中相应的线性回归方程进行比对，获得11种短链脂肪酸的含量。2.根据权利要求1所述的基于GC
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MS或GC
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MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，11种短链脂肪酸分别为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、甲基戊酸、己酸、2
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甲基己酸、正庚酸和正辛酸。3.根据权利要求2所述的基于GC
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MS或GC
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MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，使用GC
‑
MS检测时，步骤S1中不同浓度的含有11种短链脂肪酸混合标准工作液的配制方法为：分别移取11种短链脂肪酸的标准品，用第一萃取液分别配制成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00mM的含11种短链脂肪酸的混合标准工作液；使用GC
‑
MS/MS检测时，步骤S1中不同浓度的含有11种短链脂肪酸混合标准工作液的配制方法为：分别移取11种短链脂肪酸的标准品，用第一萃取液分别配制成0.01、0.05、0.20、1.00、5.00、10.00μM的含11种短链脂肪酸的混合标准工作液。4.根据权利要求3所述的基于GC
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MS或GC
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MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤S1中，分别取不同浓度的含有11种短链脂肪酸的混合标准工作液200μL，分别加入10μL的5M的酸液和50μL的0.5mM的内标进行GC
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MS检测，或者分别加入10μL的5M的酸液和50μL的50μM的内标进行GC
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MS/MS检测。5.根据权利要求1所述的基于GC
‑
MS或GC
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MS/MS测定粪便、血浆和尿液样本中短链脂肪酸含量的方法，其特征在于，步骤S2具体为：取30
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50mg固体样本或30...

【专利技术属性】
技术研发人员：李操，韩金润，秦为辉，王邹，吴泽强，杨中正，
申请(专利权)人：武汉生物样本库有限公司，
类型：发明
国别省市：