一种Septin9甲基化检测组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种Septin9甲基化检测组合物及其应用，所述组合物包括甲基化依赖型限制性内切酶、捕获寡核苷酸、通用引物和Septin9甲基化特异性引物；所述捕获寡核苷酸从5

【技术实现步骤摘要】
一种Septin9甲基化检测组合物及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种Septin9甲基化检测组合物及其应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌(CRC)是常见的胃肠道恶性肿瘤，随着人们生活习惯的改变，结直肠癌的发病率和死亡率明显上升，严重威胁着人类健康。结肠直肠癌早期症状不明显，随着肿瘤增大而表现出排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则发展为贫血、体重减轻等全身症状。
[0003]目前，临床主要采用粪便隐血试验(FOBT)和结肠镜检查进行结直肠癌筛查。作为常规的筛查方法，FOBT易受食物、药物和其他因素的影响，假阳性率高、稳定性较差。结肠镜检查是侵入性检查手段，需要肠道准备确保大肠管腔视野良好，同时，结肠镜检查存在一系列并发症，如肠活检部位容易出现肠穿孔、腹膜炎等。因此，结肠镜检查患者依从性较差。目前急需依从性高、检测方便、结果准确的结直肠癌检测方法以提高筛查准确性。
[0004]DNA甲基化是指在不改变DNA序列的前提下，在CpG岛5
’
端胞嘧啶修饰甲基化基团，造成DNA表达沉默，是目前公认的肿瘤发生机制之一。DNA异常甲基化的发生通常早于细胞癌变，因此及时检测DNA甲基化可以实现恶性肿瘤的早期预警，为肿瘤的早期筛查、早期诊断、预后和治疗评估提供重要依据。
[0005]Septin9基因位于17q25.3染色体上，Septin家族是一组高度保守的GTP结合蛋白，广泛存在于人类细胞中，在细胞分裂过程中提供结构支撑。CRC早期诊断试剂盒的检测靶点就是SEPT
‑
V2这一区域。异常甲基化的Septin9基因不仅存在于结直肠癌组织和患者外周血中，而且还与乳腺癌、卵巢癌、白血病和淋巴癌等密切相关。Grutzmann等对各种肿瘤和非肿瘤疾病患者血浆中的Septin9基因甲基化水平进行了系统研究，发现CRC患者血浆中的Septin9甲基化检出率远高于非结直肠癌肿瘤患者、非肿瘤疾病患者和正常人，说明血浆Septin9甲基化对检测CRC有较高的灵敏度和特异性，与非结直肠癌肿瘤患者、非肿瘤疾病患者和正常人具有显著性差异，这为Septin9甲基化作为CRC特有诊断标志物提供了临床依据。
[0006]虽然Septin9甲基化可以作为CRC早期筛查的有效生物标记物，但是与甲基化正常的野生型基因相比，Septin9异常甲基化的比例极低，根据不同肿瘤分期，这一比例通常仅0.01％～10％。Septin9甲基化检测的最大难题在于如何在高野生型基因背景下检测到痕量甲基化异常基因。
[0007]重亚硫酸盐转化法是最常用的甲基化检测方法，原理是采用重亚硫酸盐处理DNA，将胞嘧啶残基转化成尿嘧啶，而被甲基化的胞嘧啶残基不受影响，因此，重亚硫酸盐处理后的DNA片段只保留有甲基化胞嘧啶。基于此原理，重亚硫酸盐能在单个核苷酸水平上揭示DNA的甲基化情况。已有多种检测方法可以实现对重亚硫酸盐处理后DNA序列的分析，分析的实际问题就是重亚硫酸盐使碱基从C到U最终到T造成的区别。
[0008]但是，重亚硫酸盐转化法也存在诸多不足：(1)重亚硫酸盐测序需要确保重亚硫酸
盐转化反应完全，即每一个未被甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，如果转化反应不完全则会出现假阳性结果；(2)由于只有单链DNA的胞嘧啶才能被重亚硫酸盐攻击，在转化前需要对DNA进行变性解链，必须严格控制温度、盐浓度等因素，否则会造成转化失败或转化不完全；(3)DNA在转化反应过程中有可能被降解，如果孵育时间过长、温度和重亚硫酸盐浓度过高，可能导致高达90％的DNA被降解，降解后的DNA脱嘌呤形成随机断裂，可能导致PCR扩增失败或DNA样本数量少，准确性低，进而出现检测假阴性；(4)重亚硫酸盐处理会显著降低样本的复杂性，使得多重PCR引物设计更加困难，误差增加。
[0009]因此，发展一种高灵敏度DNA甲基化检测方法，不需重亚硫酸盐处理、不需设置对照反应，成为迫切需要解决的问题。

技术实现思路

[0010]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种Septin9甲基化检测组合物及其应用，基于甲基化依赖型限制性内切酶和通用引物，并采用荧光定量PCR技术，检测与结直肠癌密切相关的Septin9基因特殊位点上的甲基化情况，具有不需要重亚硫酸盐转化、操作简单、准确性高和特异性强的优点。
[0011]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0012]第一方面，本专利技术提供了一种Septin9甲基化检测组合物，所述组合物包括甲基化依赖型限制性内切酶、捕获寡核苷酸和通用引物；
[0013]所述捕获寡核苷酸从5
’
端到3
’
端依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列；
[0014]所述折叠序列与Septin9甲基化位点经甲基化依赖型限制性内切酶酶切后的5
’
末端序列至少部分相同；
[0015]所述结合捕获序列可与所检测的Septin9甲基化位点所在的片段区域进行特异性的结合。
[0016]优选地，所述组合物还包括Septin9甲基化特异性引物。
[0017]优选的，所述捕获寡核苷酸还包括第二通用序列。
[0018]优选地，所述第二通用序列位于结合捕获序列的5
’
端。
[0019]本专利技术中，Septin9甲基化检测组合物主要包括甲基化依赖型限制性内切酶和基于通用引物的荧光定量PCR检测试剂两部分：甲基化依赖型限制性内切酶通过对Septin9甲基化模板的甲基化位点进行酶切处理，形成5
’
端序列明确的中间产物；捕获寡核苷酸利用结合捕获序列捕获该中间产物，并以此作为模板进行延伸反应，在捕获寡核苷酸的3
’
末端添加与Septin9甲基化基因互补的核苷酸，从而形成延伸的捕获寡核苷酸，延伸的捕获寡核苷酸通过延伸序列与其自身内部的折叠序列进行完全匹配或非完全匹配的配对，形成半发夹结构产物，半发夹结构产物再进行延伸反应，在3
’
末端添加与分子内部的第一通用序列互补的核苷酸，进而形成完整的发夹结构产物；所述发夹式结构产物利用通用引物和/或特异性引物进行PCR扩增，结合检测探针实现了Septin9甲基化位点的荧光定量PCR检测。
[0020]优选地，所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断修饰。
[0021]优选地，所述核酸延伸阻断修饰有Spacer、硫代基团或尿嘧啶碱基中的任意一种或至少两种的组合。
[0022]优选地，所述折叠序列修饰有核酸类似物。
[0023]优选地，所述核酸类似物包括肽核酸、锁核酸、转置碱基、2'
‑
O,4'
‑
C
‑
methylene bridge RNA、2
’‑
O
‑
Methyl RNA或2
’‑
Fluoro RNA中的任意一种或至少两种的组合。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Septin9甲基化检测组合物，其特征在于，所述组合物包括甲基化依赖型限制性内切酶、捕获寡核苷酸和通用引物；所述捕获寡核苷酸从5
’
端到3
’
端依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列；所述折叠序列与Septin9甲基化位点经甲基化依赖型限制性内切酶酶切后的5
’
末端序列至少部分相同；所述结合捕获序列与所检测的Septin9甲基化位点所在的片段区域特异性结合。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述折叠序列修饰有核酸类似物；优选地，所述核酸类似物包括肽核酸、锁核酸、转置碱基、2'
‑
O,4'
‑
C
‑
methylene bridge RNA、2
’‑
O
‑
Methyl RNA或2
’‑
Fluoro RNA中的任意一种或至少两种的组合。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述通用引物的核酸序列与捕获寡核苷酸的第一通用序列相同或部分相同。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的组合物，其特征在于，所述甲基化依赖型限制性内切酶包括GlaI、FspEI、MspJI、LpnPI、AspBHI或MseI中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述组合物还包括Septin9甲基化特异性互补链。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括Septin9甲基化特异性引物；优选地，所述组合物还包括检测探针；优选地，所述检测探针标记有荧光基团和/或淬灭基团；优选地，所述荧光基团标记在检测探针的5
’
端；优选地，所述淬灭基团标记在检测探针的3
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端；优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的任意一种；优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任意一种。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的组合物，其特征在于，所述捕获寡核苷酸包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宏，杨浩，徐高连，古宏晨，
申请(专利权)人：上海慧众同康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：