一种RASS-F1甲基化检测组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种RASS

【技术实现步骤摘要】
一种RASS
‑
F1甲基化检测组合物及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种RASS
‑
F1甲基化检测组合物及其应用。

技术介绍

[0002]肺癌的五年生存率仅15％，早发现对患者的治疗极为重要。目前，对肺癌的诊断主要依据临床症状、医学影像学检测和组织病理学检查等，但是许多临床症状在中晚期才出现，同时活体取样检测也十分困难，严重影响了肺癌的早期诊断和治疗预后。
[0003]随着生物技术的发展，肿瘤标志物检测日益成为辅助肿瘤诊断、监测、用药指导和治疗评估的有效手段。肺癌在早期阶段由于无特殊症状，难以用常规方法进行检测，而一些肿瘤标志物仅能辅助诊断提示，无法用于早期筛查。DNA甲基化检测给肺癌的早期诊断与筛查带来了希望。DNA甲基化几乎存在于所有肿瘤中，成为肿瘤诊断的一个可靠靶标。DNA甲基化往往发生在早期阶段，在疾病确诊之前就能被检测出来，是肿瘤早期诊断、风险评估的一个重要指标，甲基化作为重要的肿瘤标志物，优势在于：肿瘤形成过程中甲基化发生频率很高，通常发生于肿瘤的早期阶段，且甲基化稳定存在于样本中，便于检测。
[0004]RASS
‑
F1是Dammann等于2000年在肺癌和乳腺癌细胞株中克隆的一个新型候选抑癌基因，是Ras相关区域家族1基因，因其表达产物中含有与Ras蛋白结构相关的区域，故而得名。目前，普遍认为RASS
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F1基因表达失活与启动子区特异性高甲基化、杂合性丢失和染色体缺失有关，尤其是RASSFlA基因启动子甲基化与肿瘤的关系是目前研究的热点。
[0005]在人类肿瘤中，RASSFlA基因失活的频率很高。例如，RASSFlA在70％以上小细胞肺癌、91％肾细胞癌、62％膀胱癌、7l％甲状腺癌、84％鼻咽癌和70％以上前列腺癌等中处于甲基化状态进而失活。现已明确RASSFlA基因在肺癌中表达失活的机制主要是由于其启动子区CpG岛的特异性高甲基化。虽然抑癌基因的失活还可能由突变所致，但是对该基因的研究结果表明，RASSFlA基因的突变率在肺癌中还不及10％，而RASSFlA启动子区发生高甲基化的比例在小细胞肺癌、非小细胞肺癌中分别高达100％和63％。
[0006]目前，主要利用重亚硫酸盐转化法对RASS
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F1基因甲基化进行检测。重亚硫酸盐转化法的原理是采用重亚硫酸盐处理DNA，将胞嘧啶残基转化成尿嘧啶，而被甲基化的胞嘧啶残基不受影响，因此，重亚硫酸盐处理后的DNA片段只保留有甲基化胞嘧啶。基于此原理，重亚硫酸盐能在单个核苷酸水平上揭示DNA的甲基化情况。已有多种检测方法可以实现对重亚硫酸盐处理后DNA序列的分析，分析的实际问题就是重亚硫酸盐使碱基从C到U最终到T造成的区别。
[0007]但是，重亚硫酸盐转化法也存在诸多不足：(1)重亚硫酸盐测序需要确保重亚硫酸盐转化反应完全，即每一个未被甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，如果转化反应不完全则会出现假阳性结果；(2)由于只有单链DNA的胞嘧啶才能被重亚硫酸盐攻击，在转化前需要对DNA进行变性解链，必须严格控制温度、盐浓度等因素，否则会造成转化失败或转化不完全；(3)DNA在转化反应过程中有可能被降解，如果孵育时间过长、温度和重亚硫酸盐浓度过高，可能导致高达90％的DNA被降解，降解后的DNA脱嘌呤形成随机断裂，可能导致PCR扩
增失败或DNA样本数量少，准确性低，进而出现检测假阴性；(4)重亚硫酸盐处理会显著降低样本的复杂性，使得多重PCR引物设计更加困难，误差增加。
[0008]因此，发展一种高灵敏度DNA甲基化检测方法，不需重亚硫酸盐处理、不需设置对照反应，成为迫切需要解决的问题。

技术实现思路

[0009]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种RASS
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F1甲基化检测组合物及其应用，基于甲基化依赖型限制性内切酶和通用引物，并采用荧光定量PCR技术，检测RASS
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F1基因特殊位点上的甲基化情况，具有不需要重亚硫酸盐转化、操作简单、准确性高和特异性强的优点。
[0010]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]第一方面，本专利技术提供了一种RASS
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F1甲基化检测组合物，所述组合物包括甲基化依赖型限制性内切酶、捕获寡核苷酸和通用引物；
[0012]所述捕获寡核苷酸从5
’
端到3
’
端依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列；
[0013]所述折叠序列与RASS
‑
F1甲基化位点经甲基化依赖型限制性内切酶酶切后的5
’
末端序列至少部分相同；
[0014]所述结合捕获序列与所检测的RASS
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F1甲基化位点所在的片段区域特异性结合。
[0015]优选的，所述捕获寡核苷酸还包括第二通用序列。
[0016]优选地，所述第二通用序列位于结合捕获序列的5
’
端。
[0017]本专利技术中，RASS
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F1甲基化检测组合物主要包括甲基化依赖型限制性内切酶和基于通用引物的荧光定量PCR检测试剂两部分：甲基化依赖型限制性内切酶通过对RASS
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F1甲基化模板的甲基化位点进行酶切处理，形成5
’
端序列明确的中间产物；捕获寡核苷酸利用结合捕获序列捕获该中间产物，并以此作为模板进行延伸反应，在捕获寡核苷酸的3
’
末端添加与RASS
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F1甲基化基因互补的核苷酸，从而形成延伸的捕获寡核苷酸，延伸的捕获寡核苷酸通过延伸序列与其自身内部的折叠序列进行完全匹配或非完全匹配的配对，形成半发夹结构产物，半发夹结构产物再进行延伸反应，在3
’
末端添加与其自身内部的第一通用序列互补的核苷酸，进而形成完整的发夹结构产物；所述发夹式结构产物利用通用引物和/或特异性引物进行PCR扩增，结合检测探针实现了RASS
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F1甲基化位点的荧光定量PCR检测。
[0018]优选地，所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断位点。
[0019]优选地，所述核酸延伸阻断位点位于折叠序列的3
’
端，用于隔断结合捕获序列和折叠序列。
[0020]优选地，所述核酸延伸阻断位点修饰有Spacer、硫代基团或尿嘧啶碱基中的任意一种或至少两种的组合。
[0021]优选地，所述折叠序列修饰有核酸类似物。
[0022]优选地，所述核酸类似物包括肽核酸、锁核酸、转置碱基、2'
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O,4'
‑
C
‑
methylene bridge RNA、2
’‑
O
‑
Methyl RNA或2
’‑
Fluoro RNA中的任意一种或至少两种的组合。
[0023]优选地，所述通用引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
MgCl2和PCR缓冲液；优选地，所述体系还包括100～300nM RASS
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F1甲基化特异性引物。9.一种RASS
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F1甲基化检测方法，其特征在于，所述方法包括：采用甲基化依赖型限制性内切酶对待测RASS
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F1甲基化模板进行酶切处理，将酶切处理后的产物加入权利要求8所述的体系中，进行荧光定量PCR；优选地，所述酶切处理的温度为30～40℃；优选地，所述酶切处理的时间为0.5～2h；优选地，所述荧光定量PCR的程序...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宏，杨浩，徐高连，古宏晨，
申请(专利权)人：上海慧众同康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：