用于鉴定和验证共有候选抗原和共有抗原特异性T淋巴细胞对的方法和系统技术方案

本发明专利技术涉及用于鉴定和验证候选抗原及其同类抗原特异性T淋巴细胞对的方法和系统，其可用于验证配对的抗原和TCR序列的免疫原性活性。本方法包括确定与参照样品相比在获得自患者组的样品中转录更高的一种或多种剪接变体，确定存在于所述一种或多种剪接变体的氨基酸翻译中但不存在于参照样品的相应剪接变体的氨基酸翻译中的一种或多种氨基酸序列，并预测氨基酸序列的HLA结合以鉴定候选的共有抗原的步骤等。本发明专利技术还涉及表征和/或治疗包括癌症在内的医学病况的方法。在内的医学病况的方法。在内的医学病况的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于鉴定和验证共有候选抗原和共有抗原特异性T淋巴细胞对的方法和系统


[0001]本专利技术涉及用于鉴定和验证候选抗原和其同类(cognate)抗原特异性T淋巴细胞对的方法和系统，其可用于验证配对抗原和TCR序列的免疫原性活性以及用于表征和/或治疗医学病况。
[0002]背景
[0003]最近，免疫疗法的重要性大大增加。在治疗或预防癌症方面尤其如此，但是免疫疗法也应用于其他医学病况，例如过敏。
[0004]已知各种免疫治疗技术，包括激活免疫疗法，例如基于树突细胞的初免和T细胞过继转移，以及使用T淋巴细胞的自体免疫增强疗法。
[0005]免疫疗法开发中出现的一个问题是功能性靶抗原和其同类T细胞和/或T细胞受体序列的鉴定。与癌症免疫疗法相关的一种普遍采用的方法是寻找源自肿瘤细胞中体细胞突变的候选新抗原，例如通过对肿瘤DNA或RNA进行深度测序。这种方法的一个目标是开发基于新抗原的癌症疫苗，其是针对个体患者的突变谱高度定制的。这种高度个性化癌症免疫疗法需要癌症患者提交他们的肿瘤DNA进行深度测序，随之完成计算机分析以鉴定可用于界定用于癌症治疗的个体癌症疫苗的候选抗原肽序列。这种方法耗时、复杂、昂贵，并且依赖于对候选肽的抗原性的最佳猜测。重要地，这种方法不能提供快速且同步鉴定同类T细胞和TCR序列。此外，它不适用于快速和/或同步功能性验证可用于开发癌症疗法的这类同类T细胞和TCR序列。这种方法的另一个难点在于虽然癌症是一种通常由致癌突变驱动的疾病，但是界定个体患者的基因谱的突变模式是唯一的，并且大多数体细胞突变的致癌性是未知的，大多数体细胞突变的抗原性也是未知的。最近对癌症相关体细胞突变的抗原性的研究发现，1,000个源自错义突变的候选抗原肽中只有不到1个导致功能性新抗原，此外，该分析并未导致鉴定从中开发定制疗法的T细胞或TCR对。实际上，当在个体癌症患者的水平上检查时，体细胞突变非常罕见，通常存在于不到0.5％的肿瘤细胞中。因此，可能难以鉴定由体细胞突变产生的功能性癌症新抗原。
[0006]通过活检组织的外显子测序以鉴定癌症相关蛋白中的错义突变来预测潜在的癌症新抗原的目前方法还存在其他限制。在分析外显子测序数据之后，接着使用旨在优先化潜在的抗原肽序列的算法来预测计算机模拟的HLA肽；然后利用这些预测的氨基酸序列(通过各种基于肽、RNA或DNA的方法)开发患者特定的癌症疫苗。这种方法有很大的局限性。由于大多数DNA突变不会导致肿瘤驱动事件，肿瘤进化期间不会选择这些“私人突变”，并且在群体水平上观察时，这种“私人突变”既不会积累也不会再发生，因此不会聚类成离散的患者亚组。相反地，有许多显示高度复发的肿瘤驱动突变的示例；例如，黑素瘤中的BRAF
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V600E，肺癌中的EGFR激酶结构域突变，乳腺癌中的HER2扩增和突变，或胰腺癌、结直肠癌和肺癌中的kRas突变。有趣的是观察到上述致癌突变并不是特别具有免疫原性，也没有导致靶向免疫疗法的成功开发。因此，非常需要开发提供快速有效地鉴定和验证癌症患者群体共有的癌症抗原的方法和系统。此外，肽抗原预测算法可能不适用于预测与某些HLA等位基
因(例如亚洲人常见的那些)结合的肽。相反，预测与亚洲人特异性HLA等位基因结合的肽新抗原可能不适合作为非亚洲人群共同的HLA等位基因的结合伴侣。因此，需要的是稳健的系统和方法，其提供对任何候选抗原
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HLA复合物的评估以便可使用任何HLA亚型完成抗原
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T淋巴细胞对的筛选。非常需要提供快速有效地鉴定和表征结合并破坏呈递共有抗原的肿瘤的同类抗原定向T细胞伴侣和T细胞受体的系统和方法。总之，仍然需要能够快速鉴定和验证共有癌症抗原和抗原特异性T淋巴细胞的功能性免疫调节对。
[0007]先前还提出了新抗原可能来自异常调控的mRNA剪接事件。然而，经由这种方法开发癌症免疫疗法仍然具有挑战性。例如，很难鉴定肿瘤特异性的mRNA剪接事件，这是鉴定癌症相关剪接变体蛋白(SVP)必不可少的步骤，SVP可作为源自剪接的抗原来源进行评估。开发稳健标示与癌症相关的RNA剪接中的变化以使针对存在于疾病和正常组织中的抗原的免疫疗法引起的脱靶毒性风险最小化的系统也是至关重要的。检测源自异常调控的mRNA剪接事件的蛋白质变体也存在重大挑战，因为在以低丰度存在的转录本中发现了许多可变剪接事件。即使发现剪接变体翻译成蛋白质的证据时，也不能保证源自全长蛋白质的肽将具有免疫原性活性。
[0008]因此，通常期望克服或改善一个或多个上述难点。本专利技术为发现和开发精确免疫疗法的这些问题提供了解决方案。
[0009]概述
[0010]本专利技术基于以下认识：异常调控的前mRNA剪接事件是患者亚组之间共有的，并且源自蛋白质剪接形式的肽解决了在免疫疗法中开发新抗原的限制。本文定义的方法教导了一种或多种候选抗原的鉴定和验证，该候选抗原是具有特定医学病况(如，癌症)的患者亚组共有的。这可以允许基于一种或多种经验证的共有候选抗原为该患者亚组快速开发诊断测试和治疗选择。本文定义的方法还教导了结合并识别一种或多种源自异常调控的mRNA剪接的共有抗原的一种或多种同类T淋巴细胞和T细胞受体(TCR)的鉴定和验证：该方法进一步教导共有抗原和其同类T淋巴细胞也是具有特定医学病况(如，癌症)的患者亚组共有的。这也可以允许基于一种或多种经验证的共有抗原为该亚组患者快速开发T细胞治疗选择。本文定义的方法还教导了平行验证一对或多对抗原和同类T淋巴细胞。这些对也是具有特定医学病况(如，癌症)的患者亚组共有的。这也可以允许基于一个或多个经验证的免疫治疗对为该患者亚组快速开发基于TCR的治疗选择。
[0011]先前未证明经由编码序列的变化导致与癌症相关的蛋白质序列变化的异常mRNA剪接事件也可能导致癌症患者中抗原肽的呈递。先前也未确定癌症患者中与肿瘤相关的剪接变化是否会导致共有癌症抗原的发展，或这种候选共有抗原肽是否在肿瘤细胞上展示，和/或这种表面展示的HLA
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肽抗原是否会结合并激活功能上杀死具有共有mRNA剪接事件的肿瘤细胞的同类T淋巴细胞。
[0012]本文公开了鉴定用于表征和/或治疗医学病况的一个或多个共有候选抗原的方法，该共有候选抗原是患有该医学病况的患者亚组共有的，该方法包括：
[0013](i)获得来自患有该医学病况的第一组患者的测试样品的转录组数据；
[0014](ii)获得一组参照样品的参照转录组数据；
[0015](iii)通过将转录组数据与参照转录组数据进行比较，确定与参照样品相比在测试样品亚组的各个样品中转录更高的一个或多个剪接变体；
[0016](iv)对于各个所述共有剪接变体，确定存在于共有剪接变体的氨基酸翻译中但不存在于参照样品中转录的同一基因的相应剪接变体的氨基酸翻译中的一个或多个氨基酸序列；以及
[0017](v)预测一个或多个共有氨基酸序列或其部分的HLA结合，以将一个或多个共有氨基酸序列鉴定为一个或多个共有候选抗原。
[0018]本文公开了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种鉴定用于表征和/或治疗医学病况的一种或多种共有候选抗原的方法，所述方法包括：(i)获得来自患有所述医学病况的第一患者队列的测试样品的转录组数据；(ii)获得一组参照样品的参照转录组数据；(iii)通过将转录组数据与参照转录组数据进行比较，确定与参照样品相比在测试样品子集的各个样品中转录更高的一种或多种剪接变体；(iv)对于每种所述共有剪接变体，确定存在于所述共有剪接变体的氨基酸翻译中但不存在于参照样品中转录的同一基因的相应剪接变体的氨基酸翻译中的一种或多种氨基酸序列；以及(v)预测一种或多种共有氨基酸序列或其部分的HLA结合，以将一种或多种共有氨基酸序列鉴定为一种或多种共有候选抗原。2.根据权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(iv)之前对于每种所述共有剪接变体，确定第一共有剪接变体相对于同一基因的一种或多种相应剪接变体在阅读框中是否有变化。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(iv)包括确定共有剪接变体和同一基因的相应剪接变体之间的非重叠核苷酸序列。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包括所述共有剪接变体的子集包括多于阈值数目或多于阈值百分比的测试样品。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括确定在多于预定比例的第一患者队列中存在的一种或多种共同HLA等位基因；其中步骤(v)包括：从所述一种或多种氨基酸序列产生多种候选肽；和预测多种共有候选肽与由所述一种或多种共同HLA等位基因编码的蛋白质的结合。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中参照样品组包括来自所述第一患者队列的匹配的正常样品。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述参照样品组包括来自未患有所述医学病况的受试者队列的样品。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述医学病况是癌症。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述医学病况是胃癌、头和颈癌、结直肠癌或肝细胞癌。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一患者队列具有特定HLA亚型。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述医学病况是一组患者共有的。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述共有候选抗原是MARK3、NBPF9、PARD3、ZC3HAV1、YAF2、CAMKK1、LRR1、ZNG670、GRINA或MZF1剪接变体，并且HLA等位基因是HLA
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A11或HLA
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A24。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述剪接变体包含与SEQ ID NO:1、31
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38、51或52中的任一个具有至少80％序列同一性的肽，或编码与SEQ ID NO:1、31
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38、51或52中的任一个具有至少80％序列同一性的肽的核酸。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括验证或测试所述一种
或多种共有氨基酸序列的HLA结合以将所述一种或多种共有氨基酸序列鉴定为共有候选抗原。15.一种鉴定共有抗原
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T淋巴细胞对的方法，所述方法包括：a)根据权利要求1至14中任一项鉴定共有候选抗原；提供一种或多种分别标记的生物分子，其包含标记物和含有共有候选抗原的肽；b)使一种或多种标记的生物分子与一个或多个包含来自患有医学病况的患者的外周血的样品接触；以及c)从所述一个或多个样品中鉴定与所述标记的生物分子结合的T淋巴细胞，从而鉴定共有抗原
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T淋巴细胞对。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述标记的生物分子包含HLA多聚体。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中包含分别的共有候选抗原的标记的生物分子用不同的分别的条形码标记。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述条形码是重金属条形码。19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中患有所述医学病况的分别的患者是不与第一患者队列重叠的第二患者队列的一部分。20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述方法包括测试T淋巴细胞的生物学功能。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法包括表征所述T淋巴细胞以确定它们是否具有细胞毒性和/或测试所述共有抗原是否具有免疫原性。22.一种用于鉴定与根据权利要求1至14中任一项鉴定的一种或多种共有候选抗原特异性结合的T淋巴细胞的方法，所述方法包括：(i)提供一种或多种分别标记的生物分子，其包含标记物和分别的共有候选抗原；(ii)使一种或多种标记的生物分子与一个或多个包含来自患有所述医学病况的分别的患者的外周血的样品接触；以及(iii)从一个或多个样品中鉴定与所述标记的生物分子结合的T淋巴细胞。23.根据权利要求22所述的方法，其中与所述标记的生物分子结合的T淋巴细胞的鉴定将分别的患者表征为患有与所述一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况。24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述方法包括测试T淋巴细胞的生物学功能。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述方法包括表征T淋巴细胞以确定它们是否具有细胞毒性和/或测试所述共有抗原是否具有免疫原性。26.一种表征受试者中的医学病况的方法，所述方法包括确定根据权利要求15至21中任一项鉴定的一种或多种共有抗原的水平，其中与参照相比增加的一种或多种共有抗原的水平将医学病况表征为与一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况。27.一种治疗受试者中的医学病况的方法，所述方法包括：(a)确定根据权利要求15至21中任一项鉴定的一种或多种共有抗原的水平，其中与参照相比增加的一种或多种共有抗原水平将受试者中的医学病况表征为与一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况，和(b)治疗发现患有与一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况的受试者。
28.一种表征受试者中的医学病况的方法，所述方法包括确定与根据权利要求15至21中任一项鉴定的一种或多种共有抗原特异性结合的T淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的T淋巴细胞水平将医学病况表征为与一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况。29.一种治疗受试者中的医学病况的方法，所述方法包括a)确定与根据权利要求15至21中任一项鉴定的一种或多种共有抗原特异性结合的T淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的T淋巴细胞水平将医学病况表征为与一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况；和b)治疗发现患有与一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况的受试者。30.一种治疗受试者中的医学病况的方法，所述方法包括：(a)确定与根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，
类型：发明
国别省市：