HER2/CEP17基因检测探针及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，尤其涉及HER2/CEP17基因检测探针及其应用。本发明专利技术通过对多个核酸片段进行筛选，获得最优标记效果的探针。本发明专利技术提供的探针基于FISH技术对样品进行检测，将其作为乳腺癌诊断的试剂，能够获得更准确、更灵敏的检测效果。更灵敏的检测效果。

Her2/cep17 gene detection probe and its application

【技术实现步骤摘要】
HER2/CEP17基因检测探针及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及HER2/CEP17基因检测探针及其应用。

技术介绍

[0002]乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，是由乳房组织发展成的癌症。研究表明，一种受体型的酪氨酸激酶
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人类表皮生长因子受体2(HER2)在20％～30％的原发性乳腺浸润性导管癌中有基因的扩增和蛋白的过度表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强，无病生存期短，预后差。《2005 St Gallen国际治疗指南》指出，在乳腺癌风险级别评估因子当中，虽然淋巴结状态仍然是最重要的因素，但HER2状态直接影响风险的级别。当淋巴结阴性或只有1～3个淋巴结有转移时，如HER2过表达或基因扩增则风险级别分别由低上升为中，中上升为高。另外，把HER2状态作为乳腺癌药物(环磷酞胺、阿霉素、5
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氟尿嚓咙和曲妥珠单抗)治疗的主要参考指标。曲妥珠单抗(赫赛汀)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于HER2的细胞外部位，适用于治疗HER2过度表达的乳腺癌。由于只有HER2过度表达和基因扩增的乳腺癌患者用曲妥珠单抗治疗才有效，因此正确检测和评定乳腺癌的HER2状态至关重要。
[0003]HER2基因位于17号染色体上，大约有47％的乳腺癌存在17号染色体非整体性(aneusomy)，即17号染色体不是正常的二体(2条17号染色体)，而是单体(1条17号染色体)或多体(3条或以上17号染色体)。在检测中应将17号染色体的非整体性和单纯的HER2基因扩增，尤其是低水平的扩增区分开。当HER2基因与17号染色体数目比值大于2时，即为HER2基因扩增。因此，在检测HER2的同时检测17号染色体着丝粒作为对照，就排除了单色探针(探针中仅有HER2基因)可能造成的假阴性(17号染色体单体)或假阳性(17号染色体多体)。
[0004]当HER2/CEP17比值＞2.0时，为HER2阳性；HER2/CEP17比值<2.0，但平均HER2拷贝数/细胞≥6.0时也为HER2阳性。扩增细胞应均质、连续，且占浸润癌的10％以上。需要注意的是对于HER2/CEP17比值≥2.0，但平均HER2拷贝数/细胞<4.0的病例是否应该视为ISH阳性目前尚存一定争议。
[0005]目前一般采用免疫组织化学(IHC)检侧HER2受体蛋白过度表达，应用荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization,FISH)和显色原位杂交(chromogenic in situhybridization,CISH)法检测HER2基因扩增的水平。其中，FISH是一种分子细胞遗传学技术，通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交。在荧光显微镜下，于细胞和(或)组织原位观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信息。临床使用美国FDA已经批准的探针对HER2进行检测，但其标记效果仍有待进一步提高。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供标记效果更好的尤其涉及HER2/CEP17基因检测探针及其应用。
[0007]本专利技术提供了HER2基因的检测探针，其为17号染色体上第39655584位～39817309位核酸。
[0008]本专利技术所述的HER2基因的检测探针来自HER2基因的BAC克隆。本专利技术所述的HER2基因的检测探针即为命名为RP11
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94L15的BAC克隆。经验证，该探针的标记效果优于HER2基因的BAC克隆：CTD
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2019C10、RP11
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1044P23或RP11
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62N23。
[0009]本专利技术所述HER2基因的检测探针上标记orange 552dUTP。
[0010]所述orange 552dUTP的标记方法采用缺口平移法。作为优选，标记温度为15℃，标记时间为1h，将标记产物放置冰上加入Stop buffer 5μl，65℃5min终止反应。
[0011]标记后的探针用纯化柱进行纯化，每个探针过柱后的所有反应液合并。用乙醇沉淀，DEPC水溶解测定浓度。
[0012]本专利技术还提供了CEP17位点的检测探针，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0013]本专利技术查找并筛选人17号染色体着丝粒的高特异性区域，最终获得序列如SEQID NO:1所示的片段标记效果最优。然后，通过人工合成含有此序列的质粒pUc
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CEP17。
[0014]本专利技术提供的CEP17位点检测探针上标记CF488AdUTP。
[0015]CEP17位点检测探针的标记采用PCR法。以含有标记的专用PCR mix对核酸序列进行扩增和标记。
[0016]本专利技术所述检测探针在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。
[0017]本专利技术所述诊断包括根据患者HER2是否过表达选择治疗药物。
[0018]HER2过表达或称为HER2阳性，该类患者应给予药物赫赛汀或拉帕替尼。
[0019]本专利技术还提供了一种乳腺癌的诊断试剂，其包括本专利技术所述的检测探针。
[0020]本专利技术中所述的诊断试剂中，还包括Human cot
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1和FISH试剂。
[0021]检测中添加Human cot
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1能够封闭样品中的DNA重复序列，减少非特异性结合。
[0022]本专利技术所述诊断试剂中，HER2基因检测探针、CEP17基因检测探针和Human cot
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1的质量比为0.05:1:25。
[0023]本专利技术所述FISH试剂包括3M醋酸钠、无水乙醇、70vol％乙醇和探针杂交液。
[0024]本专利技术中，所述探针杂交液包括硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺和2
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SSC。
[0025]本专利技术通过对多个核酸片段进行筛选，获得最优标记效果的探针。本专利技术提供的探针基于FISH技术对样品进行检测，将其作为乳腺癌诊断的试剂，能够获得更准确、更灵敏的检测效果。
附图说明
[0026]图1示ENZO试剂盒标记(bac克隆标记效果)
[0027]图2示质粒DNA荧光标记结果；
[0028]图3示4个不同病例的乳腺组织切片结果；
[0029]图4示基因组中HER2的位置。
具体实施方式
[0030]本专利技术提供了尤其涉及HER2/CEP17基因检测探针及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领
域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.HER2基因的检测探针，其为17号染色体上第39655584位～39817309位核酸。2.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于，所述探针上标记orange 552 dUTP。3.CEP17位点的检测探针，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求3所述的检测探针，其特征在于，所述探针上标记CF488A dUTP。5.权利要求1～4所述检测探针在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述诊断包括根据患者HER2是否过表达选择治疗药物。7.一种乳腺癌的诊断试剂，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘一丁，李先坤，王艺杰，
申请(专利权)人：郑州科蒂亚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：