旋转聚集的神经微球及其应用制造技术

本发明专利技术涉及获得神经微球的方法，其包括以下步骤：培养多能干细胞(PSC)，将PSC分化为神经干前体母细胞，将神经干前体母细胞聚集以形成神经微球，使神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟，以及收集神经微球。以及收集神经微球。以及收集神经微球。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】旋转聚集的神经微球及其应用


[0001]本专利技术总体上涉及干细胞领域，例如人胚胎干细胞领域。提供了用于获得干细胞衍生的神经细胞的方法。具体而言，提供了用于获得包含神经细胞的干细胞衍生的神经微球的方法。
[0002]背景
[0003]使用人多能干细胞治疗各种病症的前景似乎非常有希望。治疗包括神经系统病况如帕金森病和卒中的细胞替代疗法。然而，为了使这类治疗变得可行，需要开发体外方法来人工生产干细胞衍生的产品，以将其递送至中枢神经系统(CNS)。
[0004]将人多能干细胞(hPSC)分化为神经元谱系的过程已成为二维贴壁培养格式的高效且稳健的过程。为此，hPSC经历了通常概括发育的数个阶段，首先从有丝分裂的hPSC分化为有丝分裂的神经干细胞或神经前体干细胞(NPSC)，然后它们分化(任选地)为最小程度有丝分裂的或有丝分裂后的中间前体，放射状胶质细胞或神经母细胞阶段(统称为NB细胞)，最后分化为终末分化的有丝分裂后神经元。从神经前体干细胞或母细胞(NSPBC)到神经元的二维分化产生了高神经元纯度的培养物，这些培养物的特征在于广泛的神经突生长和神经元之间的相互连接性。然而，就其物理性质而言，这些培养物在本质上是结构/物理上脆弱的网络。存在一些涉及在三维结构中产生神经元的三维悬浮培养步骤的方案，但是这些方案由于通常包含有丝分裂神经细胞的生态位而效率低下，并且通常非常大且不适合移植到CNS。
[0005]广泛的神经突生长、连接性和脆弱性使得物理操作、收集或浓缩二维贴壁神经元培养物以供递送至CNS而不引起显著水平的细胞死亡是不可能的。为了在CNS中放置额外的神经元，例如对于细胞治疗目的，主要方法是移植神经干前体细胞(NSPC)和/或神经母细胞的制品，并允许在体内分化为神经元。NSPC不具有终末分化的神经元的脆弱结构，并且可以用酶和/或螯合剂解离并浓缩为单(或2
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10个细胞簇)细胞悬浮液，以便它们可以装入神经外科所需的细直径外科递送装置中。然后在体内分化为神经元和终末分化的细胞类型；然而，这个过程需要数天到数月才能完成，并且不容易控制，因为在体外用来促进和指导这一过程的外源性因素不能轻易地递送到CNS，并且在成人大脑中不存在或最低限度地存在。
[0006]将NSPBC移植到CNS会带来几个问题。递送至CNS的NSPBC制品完全或基本上由有丝分裂细胞组成，它们在过度生长或潜在肿瘤形成方面存在安全风险。此外，神经细胞疗法的主要施用方法是通过将神经元功能地整合到宿主回路网络中。有丝分裂神经干细胞制品必须在体内进一步分裂并分化为神经元，然后才能实现移植细胞的功能整合，这一过程在移植后很长时间内发生。NSPC也是多能的，并且可以生成数种终末细胞类型。NSPC可以在体外或体内成熟为终末细胞类型，如神经元。需要控制神经干细胞分化过程，以确保所需亚型的高度均质的终末分化群体。在体外，这个过程从开始到结束可以完全控制，其中用蛋白质和小分子处理细胞，从起始的未分化细胞(hPSC)一直到终末/有丝分裂后阶段(即神经元)，并导致高纯度的培养物。相比之下，体内分化的效率明显较低。控制体内分化的困难是由于出生后中枢神经系统是NSC疗法的移植部位。具体来说，大脑在移植后是封闭的，而无法将促
分化分子轻易地递送至移植的细胞(而且对邻近的成体组织也不是没有附带影响)。成人大脑不会产生发育信号来指导分化，也没有发育生态位、指导线索或控制分化的化学梯度。
[0007]神经球是自人多能干细胞(hPSC)的神经分化方案出现以来已广泛使用的一种培养格式，主要由NSC和祖细胞组成。重要的是，神经球的尺寸非常大，通常包含数千个细胞，测得直径为数百微米甚至毫米，并且总是悬浮培养并经历高水平的细胞分裂，并且由于它们在大多数情况下由hPSC本身形成，因此随着时间的推移尺寸会增加。这些大小尺寸尤其不适合装配在外科装置内并递送到患者的大脑。为了将神经球分化为神经元，目前需要体内解离和移植，或者将整个或解离的神经球重新涂布到二维细胞外基质包被的体外系统上。由于神经球的尺寸很大，涂布整个神经球会导致附着不良，因此在维持这些细胞方面存在技术挑战。
[0008]目前，将NSC成熟为神经元(高纯度，>80％神经元)的所有体外方法都需要与细胞外基质(ECM)接触。NSC或整个重新涂布或解离的神经球的解离单层2D培养物需要添加细胞外基质(ECM)来进行神经突形成和神经元分化。
[0009]存在用于生成包含神经谱系细胞的球体如神经球的备选方法。然而，它们在几个方面有所不同：通常，它们是通过自发聚集而生成的，这不会产生尺寸一致的球体，产生具有异质细胞组成的球体，并产生更大尺寸的球体。据报道，自发聚集的球体和旋转聚集的球体通常直径约为200
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1000μm，每个球体接种>1000个、最多达10,000个细胞，尺寸太大，无法使用递送细胞溶液体积的标准方法经由直径约为70
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120μm(对于啮齿动物)或900
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1100μm(对于人类)的套管递送到CNS中。由于它们的异质细胞性质和这类大尺寸细胞结构中营养物扩散的问题，这些较大尺寸通常在球体中心具有坏死核心。很少有旋转聚集方法被报道用于神经目的，并且都使用hPSC作为起始材料。在使用hPSC作为起始材料时，这些旋转方法需要图案化/分化和体外培养，从而产生大的神经球。存在解决上述挑战的方法。WO2018096278描述了通过定制封装技术和用来将细胞培养并分化为神经元的专门生物反应器，通过作为嵌套在细胞外基质蛋白层和溶液内的小细胞簇以3D执行整个或一部分分化，将神经元置于体内而不损害其活力。然而，根据WO2018096278的方法需要复杂的定制生物打印机器，并产生包含细胞外基质和至少包含包封残余物的最终产品。当旨在提供对患者安全的治疗时，从药学角度来看，这是不希望的。
[0010]因此，本专利技术的一个目的是克服上述挑战，特别是提供用于获得适合于递送给患者的基于干细胞的纯神经元产品的简单方法。

技术实现思路

[0011]另外，本专利技术还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
[0012]本专利技术的第一方面是提供获得神经微球的方法，其包括以下步骤：提供神经干前体母细胞，将所述神经干前体母细胞聚集以形成神经微球，以及使所述神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟。在一个实施方案中，提供神经干前体母细胞包括培养多能干细胞(PSC)以及将所述PSC分化为神经干前体母细胞的步骤。由此可见，本专利技术的一个方面涉及神经微球，其包含可根据上述方法获得的神经细胞。本专利技术的另一方面涉及用作药物产品的神经微球。具体而言，它涉及神经微球用于治疗神经病况的用途。在本专利技术的一个实施方
案中，所述神经微球的神经细胞是用于治疗帕金森病的中脑神经元，如多巴胺能祖细胞。
[0013]本专利技术提供了通过聚集，如受控旋转聚集，在最小(例如，不需要外源性细胞外基质组分或其他生物材料如水凝胶或藻酸盐)和静态非贴壁条件下体外形成神经微球的方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.获得基于干细胞的微球的方法，其包括以下步骤：
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分化PSC以获得分化细胞，
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将所述分化细胞聚集以形成基于干细胞的微球，以及
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使所述基于干细胞的微球的所述分化细胞进一步成熟。2.根据前述权利要求所述的方法，其中在聚集所述分化细胞之前，将所述PSC分化至少2天。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在聚集步骤之前，将所述PSC分化一段时间，由此至少50％的所述分化细胞不再是多能的。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分化细胞通过旋转聚集而聚集。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基于干细胞的微球在具有低细胞附着性质的环境中成熟。6.获得神经微球的方法，其包括以下步骤：
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将PSC分化为神经干前体母细胞，
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将所述神经干前体母细胞聚集以形成神经微球，以及
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使所述神经微球的所述神经干前体母细胞进一步成熟。7.根据权利要求6所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：