基于细胞的用于测定肉毒杆菌毒素活性的方法技术

本发明专利技术涉及用于确定肉毒杆菌毒素活性的细胞和抗体，以及使用它们测定活性的方法。当前，在肉毒毒素效力的测量领域中，需要开发基于细胞的效力测定法(CBPA)来代替小鼠LD50生物测定法(mLD50)。本发明专利技术用于肉毒杆菌毒素活性测定的细胞和抗体是CBPA替代mLD50的细胞和抗体，与用于测定肉毒杆菌毒素活性的常规SiMa细胞相比，该细胞系具有明显更短的分裂时间并且对肉毒杆菌毒素的敏感性明显高于亲本细胞系，因此非常适合检测毒素以及确定基于细胞的肉毒杆菌毒素活性。使用本发明专利技术的细胞和抗体的CBPA测定可望成为一种高度可靠和可重复的基于细胞的肉毒杆菌毒素的效价测定方法。于细胞的肉毒杆菌毒素的效价测定方法。于细胞的肉毒杆菌毒素的效价测定方法。

【技术实现步骤摘要】
基于细胞的用于测定肉毒杆菌毒素活性的方法
[0001]本申请是申请日为2019年8月19日，申请号为CN 2019800908385、专利技术名称为“基于细胞的用于测定肉毒杆菌毒素活性的方法”的申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及用于确定肉毒杆菌毒素活性的细胞和抗体，以及使用它们确定活性的方法。

技术介绍

[0003]目前，小鼠LD
50
生物测定(mLD
50
)是一种普遍接受的用于检测食品，临床或环境样品中残余肉毒杆菌毒素(BoNT/A)的方法。特别地，制药行业使用mLD
50
作为标准分析方法来测量用于美容或临床应用的肉毒杆菌毒素滴度。然而，由于使用 mLD50的肉毒毒素滴度测定受到测试机构/设施和研究人员的高度影响，因此难以准确、可重复地定量肉毒毒素的生物学功效。因此，为了最大程度地减少实验中使用的动物的数量和痛苦并标准化测量肉毒毒素滴度的方法，举行了ZEBET会议以鼓励开发替代性的mLD50测量方法(Altern Lab Anim.2010 Aug；38(4):315
‑
30)。在各个国家，许多研究机构和行业进行了各种研究，以开发基于细胞的滴度测定(CBPA)或基于细胞的生物测定(CBB)，就特异性、敏感性和可重复性而言，它们足以替代mLD50。为了成功建立CBPA或CBB，他们一直试图获取(1)对SNAP25
197
特异的单克隆或多克隆抗体，和(2)对低水平的肉毒杆菌毒素表现出高敏感性的神经元细胞系。早在2004年，Chapman博士和他的同事专利技术了一种将肉毒杆菌毒素与两种荧光蛋白融合的荧光报告基因测定方法(Proc Natl Acad Sci USA.2004 Oct12；101(41):14701
‑
6)，其以BoCell
TM
分析方法(Biosentinel Inc)的名称命名并商业化。尽管BoCell
TM
测定法作为第一个能够检测在98孔培养皿中培养的动物细胞的肉毒杆菌毒素的中性内肽酶活性的测定法具有重要意义，但它存在一个问题，其灵敏度却比使用小鼠的测定法低2
‑
3倍(Appl Environ Microbiol vol.78,21(2012)：7687
‑
97)。如上所述，在全球范围内一直努力开发CBPA以替代mLD50，因此最终有望终止使用动物的分析方法。尽管开发有效的CPBA仍有待解决的挑战，但开发有效的CBPA将有助于扩大各种肉毒杆菌毒素产品的用途，提高质量控制水平，为消费者提供更高水平的信心，增强肉毒杆菌毒素产品的竞争力。
[0004]因此，本专利技术旨在克服常规CPBA的局限性并开发更有效的CBPA。通过本专利技术的CPBA，对13种不同的神经元细胞系进行了比较分析，并开发了在构成神经元细胞的广泛克隆中最优化的新克隆N2
‑
42F。该克隆的分裂时间很短，小于24小时，与SiMa相比，由于它可以附着在涂有聚
‑
d
‑
赖氨酸(PDL)的培养皿中并在其中稳定培养，因此预计作为CBPA的细胞非常有用。
[0005]本专利技术还涉及一种用于CPBA的抗体，用于替代小鼠LD50生物测定(mLD50)。本专利技术中的抗体是一种对SNAP25具有显著高结合亲和力和特异性的单克隆抗体。本专利技术的抗体克服了常规CPBA的局限性，使得开发更有效的CBPA成为可能，因此有望在医药和化妆品领域得到积极应用。
SNAP25
FL
的内源性水平，在高通量分析中很难使用它们。。
[0015]在本专利技术的一个实施方案中，“肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)”是由肉毒杆菌 (Clostridium botulinum)产生的神经毒性蛋白。梭菌属超过127多种，根据其形态和功能进行分类。肉毒杆菌毒素，一种由厌氧，革兰氏阳性菌肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)产生的强效多肽神经毒素，导致人类和动物的神经麻痹性疾病称为肉毒杆菌中毒。肉毒杆菌(Clostridium botulinum)的孢子可以在土壤中发现，并可以培养在未经消毒和密封的家庭罐装食品容器中，这是许多肉毒杆菌中毒病例的原因。肉毒杆菌中毒的症状通常在食用被肉毒杆菌培养物或孢子感染的食物后18至36小时出现。肉毒杆菌毒素似乎能够通过肠壁而不降低其毒性，并且对胆碱能运动神经元具有高亲和力。肉毒杆菌毒素中毒的症状可能从行走，吞咽和说话困难发展为呼吸肌麻痹甚至死亡。 A型肉毒杆菌毒素是人类已知的最致命的天然生物剂。市售A型肉毒杆菌毒素(纯化的神经毒素复合物)的LD50约为50皮克(即1个单位)。在摩尔(M)基础上，A型肉毒杆菌毒素约比白喉致死性高18亿倍，约比氰化钠致死性高6亿倍，约比眼镜蛇毒素 (cobra toxin)致死性高3000万倍，约比霍乱致死性高1200万倍。一个单位(U)的肉毒杆菌毒素可被定义为通过腹膜内注射给每只体重18至20克的雌性瑞士韦伯斯特 (Swiss Webster)小鼠的LD50。7种不同的肉毒杆菌神经毒素在免疫学上通常被分别描述为神经毒素血清型(serotype)A、B、C1、D、E、F和G，每一种血清型通过中和类型特异性抗体来区分。血清型肉毒杆菌毒素的不同取决于它们所作用的动物种类以及它们引起的麻痹的严重程度和持续时间。例如，根据大鼠麻痹率的测定，A型肉毒毒素的效力是B型肉毒毒素的500倍。另外，B型肉毒杆菌毒素的剂量为480U/kg时仍被测定为对灵长类无毒，约A型肉毒杆菌毒素对灵长类LD50的12倍。肉毒杆菌毒素被认为与胆碱能运动神经元有明显的高亲和性结合，能进入神经元并阻断乙酰胆碱的释放。额外的吸收可以通过低亲和力受体以及吞噬作用和胞饮作用发生。无论血清型如何，毒素中毒的分子机制似乎是相似的，并且涉及至少3步。在该过程的第一步，毒素通过毒素的重链(H链或HC)和细胞表面受体之间的特定相互作用与目标神经元的突触前膜结合。每种类型的肉毒杆菌毒素和破伤风毒素的受体被认为是不同的。 HC的羧基末端段似乎对于将肉毒杆菌毒素靶向细胞表面很重要。
[0016]第二步，肉毒杆菌毒素穿过靶细胞的质膜。肉毒杆菌毒素首先通过受体介导的内吞作用被细胞吞噬，形成含有肉毒杆菌毒素的内体。然后毒素从内体逃逸到细胞的细胞质中。该步骤被认为是由重链的氨基末端片段HN介导的，HN会触发毒素的构象变化以响应约5.5的pH值。已知内体具有质子泵，可降低内体内的pH值。构象转变暴露了毒素中的疏水残基，这使得肉毒杆菌毒素能够将自身嵌入内体膜中。随后肉毒杆菌毒素(或至少肉毒杆菌毒素的轻链)通过内体膜转移到细胞质中。肉毒杆菌毒素活性机制的最后一步被认为涉及连接重链和轻链的二硫键的还原。肉毒杆菌和破伤风毒素的全部毒性活性都包含在全毒素的轻链中；轻链是一种锌(Zn++)中性内肽酶，选择性裂解含有神经递质的囊泡与质膜的细胞质表面的识别和对接以及囊泡与质膜的融合所必需的蛋白。破伤风神经毒素,B、D、F和G型肉毒杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从亲代neuro
‑
2a细胞中克隆获得的细胞系(登录号：KCTC AC28106)，其中所述克隆细胞系具有同质细胞群；其中所述克隆细胞系包含对约25pM或更小浓度的BoNT/A引起的A型肉毒杆菌毒素(BoNT/A)中毒敏感的细胞，并且细胞相较于亲本neuro
‑
2a细胞对BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C和BoNT/F表现出更高的敏感性，相较于亲本neuro
‑
2a细胞对5pM至200pM浓度的BoNT/D的敏感性相同，并且对10pM至400pM浓度的BoNT/E的无敏感性。2.如权利要求1所述的细胞系，其在至少第5代或更多传代数的细胞中表现出约0.1nM或更小的BoNT/A中毒。3.如权利要求1所述的细胞系，其在第15代细胞中表现出约0.1nM或更小的BoNT/A中毒。4.如权利要求1所述的细胞系，其用于测定肉毒杆菌毒素的活性或检测肉毒杆菌毒素。5.如权利要求1所述的细胞系，其为N2
‑
42F细胞系(登录号：KCTC 13712BP)。6.一种基于细胞的测定肉毒杆菌毒素活性的方法，包括以下步骤：(a)培养权利要求1至5中任一项所述的细胞系；(b)用肉毒杆菌毒素处理细胞系；和(c)通过特异性结合SNAP25
FL
或SNAP25
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的抗体测定细胞系中的SNAP25
FL
或SNAP25
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。7.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞系在涂有聚
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D
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赖氨酸的固体基质中培养。8.如权利要求6所述的方法，其中所述肉毒杆菌毒素为肉毒杆菌毒素血清型A。9.如权利要求6所述的方法，其中测量SNAP25
FL
或SNAP25
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是用于测定由肉毒杆菌毒素引起的内源性神经分泌蛋白的裂解。10.一种基于细胞的检测肉毒杆菌毒素的方法，包括以下步骤：(a)培养权利要求1至5中任一项所述的细胞系；(b)用肉毒杆菌毒素处理细胞系；(c)通过特异性结合SNAP25
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的抗体测定细胞系中的SNAP25
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；和(d)当检测到抗体
‑
SNAP25
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复合物时，确定样品中存在肉毒杆菌毒素。11.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞系在涂有聚
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李治建，严智炫，V，
申请(专利权)人：秀杰股份公司，
类型：发明
国别省市：