利用3D打印构建好氧真菌和兼性或厌氧微生物共存的方法技术

本发明专利技术公开了利用3D打印构建好氧真菌和兼性或厌氧微生物共存的方法，将好氧真菌接种至发酵培养基，在发酵培养基上放置带孔隙的支撑材料，使好氧真菌在支撑材料上形成致密的生物膜；通过3D打印将兼性或厌氧微生物制成栅栏结构的活体材料；将所述活体材料放入发酵培养基，与好氧真菌共存并发酵反应。本发明专利技术还提供了利用3D打印的容器和活体材料构建的生物反应器。本发明专利技术通过好氧真菌在支撑材料和在活体材料上形成的生物膜来实现氧气的消耗，为活体材料内部的兼性或厌氧微生物创造了适宜的生长和生产条件，并通过活体材料和3D打印设备设计了一个生物反应器，利用好氧菌的氧气消耗在生物反应器中产生氧梯度，满足以CBP系统为基础的化学品生产的氧气需求。础的化学品生产的氧气需求。础的化学品生产的氧气需求。

Using 3D printing to construct a method for the coexistence of aerobic fungi and facultative or anaerobic microorganisms

【技术实现步骤摘要】
利用3D打印构建好氧真菌和兼性或厌氧微生物共存的方法


[0001]本专利技术属于生物材料和合成生物学领域，具体涉及利用3D打印构建好氧真菌和兼性或厌氧微生物共存的方法。

技术介绍

[0002]随着合成生物学的快速发展，重组微生物已经生产出各种大宗和精细化学品。然而，在构建工程菌株过程中，外源基因受到的排他性和基因沉默途径的存在以及发酵过程需要的严格培养条件等因素，制约了生物制造产业的发展。通过将代谢模块划分为不同的微生物成员，微生物组合为生物化学生产的单一培养提供了一个有希望的选择。一个典型的例子是一体化生物加工过程（Consolidated bioprocessing, CBP）人工混菌系统，它在一个反应器结合了水解酶生产、木质纤维素水解、和微生物发酵。与单一培养相比，微生物组合可以提高生产效率。然而，由于难以维持不同菌株群体之间的最佳平衡，以及需要创造不同菌株所需的特定微环境条件，稳定的人工微生物共培养体系仍然困难。例如，构建这种自下而上的CBP系统的一个主要挑战是好氧真菌和兼性或厌氧微生物之间的氧浓度要求。

技术实现思路

[0003]本专利技术的第一目的在于提供利用3D打印构建好氧真菌和兼性或厌氧微生物共存的方法。
[0004]为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：利用3D打印构建好氧真菌和兼性或厌氧微生物共存的方法，包括：将好氧真菌接种至发酵培养基，在发酵培养基上放置带孔隙的支撑材料，使好氧真菌在支撑材料上形成致密的生物膜；通过3D打印将兼性或厌氧微生物制成栅栏结构的活体材料；将所述活体材料放入发酵培养基，好氧真菌在栅栏结构的活体材料形成生物膜，实现混菌共存并发酵反应。
[0005]本专利技术通过好氧真菌在支撑材料和在活体材料上形成的生物膜来实现氧气的消耗，为活体材料内部的兼性和厌氧微生物创造了适宜的生长和生产条件。
[0006]作为一种优选的实施方式，所述3D打印使用的生物墨水为双键改性的聚乙烯醇和苯硼酸功能化的海藻酸钠双交联生物墨水。生物打印活体材料应用成功的关键是生物墨水的开发。生物墨水应具有适合目标微生物的机械、流变和生物学特性。生物墨水应满足细胞在3D打印凝胶基质内均匀分布的特性，并且能满足在发酵过程中的长期使用。此外，为了在生物打印过程中有利于微生物存活，3D打印的总体方案应该具有最小的细胞毒性，包括温和的温度和没有有机溶剂的条件。目前，生物聚合物（如明胶和藻酸盐）制备的可交联水凝胶常用作生物墨水。然而，此类凝胶墨水不能满足长期稳定性的需求。例如，生物相容性的海藻酸钙凝胶它们会随着时间的推移而降解。为了克服这些缺点，一种方法是使用基因修饰工具来对目标微生物进行改造，使微生物不能降解这些生物相容的材料。然而，在长时间
的发酵过程中，凝胶结合多余的水分也会促进凝胶破裂。因此，具有更好的可加工性、更强的机械强度和对发酵介质的化学惰性功能性水凝胶亟待开发。为了满足生物墨水适合目标微生物的机械、流变和生物学特性，我们对生物墨水设计了双级交联（图1）。第一阶段的交联决定了材料在印刷过程中的流变行为，而第二阶段的交联决定了材料最终的力学性能。交联的第一阶段可以通过聚合物本身的物理作用力或加入可逆键或少量共价交联而形成。第一阶段交联技术的例子包括离子交联、主客相互作用、动态共价化学和非特异性物理作用力。当对注射器施加作用力时，物理或动态交联可以断开，凝胶将产生和流动。3D打印后，这些交联可以重新组装，材料快速自愈合，再次形成弱凝胶。然后我们在第二阶段引入更强交联机制。然而，由于交联的动态特性会导致膨胀、侵蚀和蠕变行为，使这些材料既可打印又稳定还面临许多挑战。双键改性的聚乙烯醇（PVA
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GMA）和苯硼酸功能化的海藻酸钠（PBA
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SA）具有较高的生物相容性。因此，微生物的活性和发酵能力可得以维持。PVA
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GMA和PBA
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SA之间的可逆共价交联（硼酸酯键）允许细胞在打印结构内均匀分布。此外，PVA
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GMA/PBA
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SA是剪切稀释的，可以通过挤压型的3D打印机通过注射器和喷嘴挤压，并通过计算机辅助打印成栅栏结构。随后的光聚合提高了印刷的保真度和长期稳定性。
[0007]作为一种优选的实施方式，所述3D打印使用的生物墨水中加入蓝光引发剂苯基
‑
2,4,6
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三甲基苯甲酰磷酸盐。生物墨水内部加入了蓝光引发剂苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰磷酸盐（LAP），在蓝光条件下光聚合提高了活体材料长期稳定性并用于后续发酵。
[0008]作为一种优选的实施方式，通过3D打印将兼性或厌氧微生物制成栅栏结构的活体材料的方式为：将兼性或厌氧微生物过夜培养后，与蓝光引发剂一并加入PVA
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GMA溶液中，之后将混合液与PBA
‑
SA溶液混合震荡，制成凝胶；将凝胶转移至注射筒中打印沉积成连续的丝状，每层印刷后光固化，获得打印好的栅栏结构的活体材料。
[0009]作为一种优选的实施方式，所述孔隙直径为1
‑
2mm。支撑材料中1
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2mm直径的孔隙可以满足真菌生物膜充分接触培养基。
[0010]本专利技术通过特定的计算机辅助设计，利用3D打印创造出以聚合物基质和包埋微生物为主的三维个性化和高传质的活体材料。并且，通过生物材料的尺寸、空间构型和结构形态的定制，设计的微环境可以维持微生物在生物发酵过程中的长期生存能力和代谢活动。具体的，3D打印技术可定制特定栅栏结构的活体材料，该结构具备高的比表面积，可以提高传质，以实现最大的生物转化效率。
[0011]活体材料内部可打印包埋S. cerevisiae、L. paracasei、Escherichia coli、Actinobacillus succinogenes等不同微生物作为化学品生产菌株。
[0012]本专利技术的另一目的在于提供一种利用3D打印构建好氧真菌和兼性或厌氧微生物共存的生物反应器。
[0013]所述生物反应器由容器、好氧真菌、兼性或厌氧微生物构成；所述容器上部设有进气口，用于供氧，下部设有取样口；容器中部固定发酵培养基，发酵培养基上放置带孔隙的支撑材料；所述好氧真菌接种至发酵培养基，在支撑材料上形成致密的生物膜；所述兼性或厌氧微生物通过3D打印制成栅栏结构的活体材料后放入发酵培养基；好氧真菌在容器中以
生物膜的形式与兼性或厌氧微生物制成的活体材料共存。
[0014]作为一种优选的实施方式，所述容器由3D打印制成。
[0015]作为一种优选的实施方式，所述容器为ABS材质。
[0016]作为一种优选的实施方式，所述支撑材料可拆卸的放置于发酵培养基上。
[0017]本专利技术的生物反应器中容器设计简单，价格低，体积小，方便维修，方便清洗。
[0018]本专利技术通过计算机辅助设计设计3D打印的容器，3D打印的容器和3D打印活体材料表面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用3D打印构建好氧真菌和兼性或厌氧微生物共存的方法，其特征在于，包括：将好氧真菌接种至发酵培养基，在发酵培养基上放置带孔隙的支撑材料，使好氧真菌在支撑材料上形成致密的生物膜；通过3D打印将兼性或厌氧微生物制成栅栏结构的活体材料；将所述活体材料放入发酵培养基，好氧真菌在栅栏结构的活体材料形成生物膜，实现混菌共存并发酵反应。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3D打印使用的生物墨水为双键改性的聚乙烯醇（PVA
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GMA）和苯硼酸功能化的海藻酸钠（PVA
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GMA）双交联生物墨水。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述3D打印使用的生物墨水中加入蓝光引发剂苯基
‑
2,4,6
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三甲基苯甲酰磷酸盐。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过3D打印将兼性或厌氧微生物制成栅栏结构的活体材料的方式为：将兼性或厌氧微生物过夜培养后，与蓝光引发剂一并加入PVA
‑
GMA溶液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：信丰学，高豪，姜岷，章文明，蒋羽佳，姜万奎，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：