亚隔孢壳属内生真菌及其次生代谢产物的提取方法和应用技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，公开了一种亚隔孢壳属内生真菌及其次生代谢产物的提取方法和应用。所述菌株命名为Didymella segeticola Q1

【技术实现步骤摘要】
亚隔孢壳属内生真菌及其次生代谢产物的提取方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生物领域，特别是涉及一种亚隔孢壳属内生真菌及其次生代谢产物的提取方法和应用，该菌株的次生代谢产物中含有白花前胡甲素，白花前胡乙素与白花前胡E素，能够抑制前胡抽薹。

技术介绍

[0002]植物内生菌是指能够在某一阶段存在于健康植物组织中生存而不引起寄主植物明显病变的一类微生物，主要包括细菌和真菌。内生菌在植物的生长发育过程中扮演着不可或缺的角色，越来越多的学者聚焦于植物相关微生物的研究。
[0003]前胡，伞形科植物白花前胡的干燥根，始载于《名医别录》，具有解热化痰的功效，一般用于治疗某些呼吸系统疾病，比如风热感冒，痰多咳嗽，哮喘等。香豆素类为前胡的主要化学成分，主要包括角型吡喃香豆素和呋喃香豆素等，其中白花前胡甲素，白花前胡乙素，白花前胡E素是主要的角型吡喃香豆素，它们具有很多重要的生物活性，如抗炎，抗癌，抗氧化等。前胡是多年生一次开花植物，抽薹后根部逐渐木质化，在野外可生长三年至五年才开始抽薹，由于市场需求量逐渐增加，前胡种植规模越来越大，据药农反映，人工种植的前胡抽薹时间逐渐提前，一般1～2年即抽薹，其有效成分积累不足，药用价值极低。
[0004]随着人们对于化学肥料越来越依赖，导致某些农药滥用的情况，虽然短期内提高作物产量，但更多的是带来某些严重的环境污染，比如：土壤酸化、板结，营养物质低下，水体富营养化等，还有昆虫抗性以及对非目标生物(包括天敌和人类)的危害。而使用生物菌肥，在提高作物产量与质量的同时，还能够有效避免此类问题的发生，所以生物防治是近些年进行土壤结构改善或者促进植物对土壤中营养物质的吸收利用的重要途径。前胡微生物资源极其丰富，已有人从中分离出新微生物，但是暂未有报道从前胡中分离出产香豆素的内生菌，更没有研究显示内生真菌可以抑制前胡抽薹。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对前胡早薹问题，提供一种从白花前胡根中分离的产香豆素类物质、且能抑制前胡抽薹的亚隔孢壳属内生真菌。
[0006]本专利技术的另一目的是提取上述菌株次生代谢产物的方法，其次生代谢产物中含有白花前胡甲素，白花前胡乙素与白花前胡E素。
[0007]本专利技术还有一个目的是提供上述菌株次生代谢产物抑制前胡抽薹的应用。施加适宜浓度的菌悬液于前胡根部周围，能够显著降低前胡抽薹率，同时对其白花前胡甲素含量略有提高，这不仅能够改善前胡早薹问题，同时也提高前胡药材质量，对于目前过度依赖化学肥料而造成的环境问题的解决具有重要意义。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0009]一种亚隔孢壳属内生真菌(Didymellasegeticola)Q1
‑
5，是从白花前胡新鲜健康的根组织中分离得到，于2022年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为
CCTCC NO.M2022032，保藏地址为：中国湖北省武汉市武昌区武汉大学校内。
[0010]上述亚隔孢壳属内生真菌提取次菌株生代谢产物的方法，包括以下步骤：
[0011](1)取亚隔孢壳属内生真菌菌种，接种于PDA培养基上活化，取活化后的菌种接种于PDB培养基中，140～200rpm，25～40℃条件下摇床培养5～10天，得菌株发酵产物；
[0012](2)将步骤(1)所得的菌株发酵产物真空抽滤，分离得菌丝体和发酵液，用蒸馏水冲洗菌丝体，将菌丝体置于50
±
2℃条件下烘干，研磨，得菌丝体粉；将菌丝体粉按重量体积比1：20加入二氯甲烷，超声提取10min，过滤，50℃水浴蒸干，残渣用甲醇冲洗，0.22μm滤膜过滤，即得菌株次生代谢产物提取物(即菌丝提取物)。
[0013]优选步骤(1)中140rpm，28℃条件下摇床培养5～7天，得菌株发酵产物。
[0014]所述的菌种次生代谢产物含有白花前胡甲素，白花前胡乙素和白花前胡E素。
[0015]本专利技术亚隔孢壳属内生真菌能够抑制前胡抽薹、开花。优选使用菌体含量为0.01％～2.00％范围。白花前胡Didymellasegeticola菌在施用的时候与无菌水配制成菌悬液，施用量优选为10mL/次/10d，持续四个月。
[0016]上述亚隔孢壳属内生真菌菌株可以提高前胡香豆素含量。
[0017]上述亚隔孢壳属内生真菌菌株可以抑制前胡抽薹。
[0018]与现有技术比较本专利技术的有益效果：本专利技术菌株是从白花前胡根中分离得到的内生真菌，该菌株能够产生白花前胡甲素，白花前胡乙素及白花前胡E素，施加至白花前胡根中能够显著降低抽薹率，特别是在第一年生长期中，抽薹率可降低7.22％。且施加菌悬液后的白花前胡甲素含量略有提高，这不仅有效改善前胡早薹问题，还能够提高前胡药材质量。
附图说明
[0019]图1为前胡5种香豆素成分标准品的高效液相色谱图(图中，1：香豆精I，2：白花前胡甲素，3：香豆精II，4：白花前胡乙素，5：白花前胡E素)；
[0020]图2为Didymellasegeticola Q1
‑
5菌的菌丝提取物的高效液相色谱图；
[0021]图3为Didymellasegeticola Q1
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5菌的菌丝提取物的白花前胡甲素离子质谱图；
[0022]图4为Didymellasegeticola Q1
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5菌的菌丝提取物的白花前胡乙素离子质谱图；
[0023]图5为Didymellasegeticola Q1
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5菌的菌丝提取物的白花前胡E素离子质谱图；
[0024]图6为Didymellasegeticola Q1
‑
5菌株的培养特征，其中左为平板正面，右为平板反面照片。图7为Didymellasegeticola Q1
‑
5菌株的系统进化树。
具体实施方式
[0025]以下通过具体实施例对本专利技术进行进一步解释说明。
[0026]实施例1白花前胡内生真菌的分离鉴定
[0027]1、实验材料
[0028]安徽省六安市东河口前胡栽培基地白花前胡的根。
[0029]2、分离纯化
[0030]将采集的健康无病害前胡植株用剪刀剪取根部，自来水冲洗，去除表面附着的泥沙，放置超净工作台内晾干，进行表面消毒处理：置于0.1％升汞中2
‑
3min，无菌水漂洗4～5次，无菌纱布擦干，再置于75％乙醇中浸泡2～3min，无菌水漂洗6～7次，最后用无菌纱布擦
去表面附着的水分。取最后一次冲洗的无菌水涂于PDA培养基检验样品表面消毒效果。
[0031]组织切片法：用无菌剪刀将表面消毒过的前胡根纵向切开，剪取2～3mm，切面向下接入PDA培养基，每个培养皿接入3～5个组织。28
±
1℃暗培养，培养2～3d左右，可见根部边缘逐渐开始生成菌丝，用无菌竹签挑取边缘生长良好的菌丝，分别接种在新本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚隔孢壳属内生真菌(Didymellasegeticola)Q1
‑
5，其特征在于，所述亚隔孢壳属内生真菌Q1
‑
5于2022年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2022032。2.一种权利要求1所述的亚隔孢壳属内生真菌提取次菌株生代谢产物的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取如权利要求1所述的亚隔孢壳属内生真菌菌种，接种于PDA培养基上活化，取活化后的菌种接种于PDB培养基中，140～200rpm，25～40℃条件下摇床培养5～10天，得菌株发酵产物；(2)将步骤(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩邦兴，刘丽，马猛华，汪学军，朱富成，王威，王芳，宋向文，王广林，陈存武，
申请(专利权)人：皖西学院，
类型：发明
国别省市：