一种波形蛋白的提纯方法技术

本发明专利技术提供了一种波形蛋白的提纯方法，属于蛋白提纯技术领域。本发明专利技术以猪脑为原材料，通过两次盐溶液洗涤去除猪脑中盐溶性蛋白和肌球蛋白(杂蛋白，等电点接近5，通过盐溶液萃取去除)，然后利用pH值小于蛋白质等电点时，阴离子表面活性剂能引起蛋白质沉淀；pH值大于蛋白质等电点时，阳离子表面活性剂才能沉淀蛋白质的原理(波形蛋白等电点为5.05)，调节混合物pH值为5.1～5.4且十二烷基硫酸钠(SDS)浓度为50mmol/L，然后调节所得上清液pH值为4.7～4.9且SDS浓度100mmol/L，得到波形蛋白。本发明专利技术利用等电点和十二烷基硫酸钠(SDS)法实现了波形蛋白的分离纯化。蛋白的分离纯化。蛋白的分离纯化。

【技术实现步骤摘要】
一种波形蛋白的提纯方法


[0001]本专利技术涉及蛋白提取
，尤其涉及一种波形蛋白的提纯方法。

技术介绍

[0002]波形蛋白为极度保守的细胞骨架III型中间丝蛋白，分子量为53～57kDa，等电点5.05，在pH值7.2～7.4最稳定。波形蛋白可在细胞外表达，主要以细胞分泌、细胞破裂后释放的形式存在，具有固有免疫调节功能，参与淋巴细胞增殖过程，具有生物药品开发的前景。
[0003]目前，研究人员开发了多种波形蛋白的分离纯化工艺，比如Nelson等(Nelson W J,Traub P.Purification ofthe intermediate filament protein vimentinfrom Ehrlich ascites tumor cells.[J].Journal of Biological Chemistry,1982,257(10):5536.)在体外培养艾氏腹水瘤细胞，通过DEAE
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纤维素层析以6M尿素溶液纯化得到波形蛋白。有学者(Hans,Bloemendal M,Willemsen G,etal.Isolation of the intermediate filament protein vimentin bychromatofocusing.[J].FEBS letters,1985,180(2):181
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184.)以牛晶状体原料，分别用SephadexG25柱和PBE94聚焦层析法、SephadexG
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25柱和羟基磷灰石柱分离纯化得到波形蛋白。Hartzer等(Hartzer,Michael Kenneth,Purification and properties of porcine cardiac desmin and vascular smoothmuscle vimentin[D].Retrospective Theses and Dissertations.1984,8171.)依次用DEAE纤维素柱、羟基磷灰石柱和DEAE
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Sepharose CL
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6B柱从猪主动脉平滑肌纯化得到波形蛋白。后来有学者开始采用猪眼晶状体，Geisler等(Geisler N,Weber K.Isolation of polymerization
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competent vimentin fromporcine eye lens tissue[J].FEBS Letters,1981,125(2).)用SephadexG
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25、CM
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32及DE52三次过柱纯化得到波形蛋白，苏永新等(苏永新，郭寿延，王宝美.中间丝波形蛋白抗原提纯、抗体制备和初步应用[J].中华病理学杂志，1989，18(01):30
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33.)用DE52及CM
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32两次过柱纯化得到波形蛋白。
[0004]然而，上述波形蛋白纯化方法主要以猪或牛眼晶状体为原材料，采用多种层析柱分离提取，原材料不易获得，且提取时间较长，纯化过程复杂。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种波形蛋白的提纯方法，所述提纯方法无需过柱，方法简单，时间短。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种波形蛋白的提纯方法，包括以下步骤：
[0008]将猪脑、第一盐溶液和聚乙二醇单辛基苯基醚混合，进行第一洗涤，得到第一沉淀；
[0009]将所述第一沉淀重悬于第二盐溶液，进行第二洗涤，得到第二沉淀；
[0010]将所述第二沉淀与PBS缓冲液混合后，调节所得混合物的pH值为5.1～5.4，加入十
二烷基硫酸钠直至十二烷基硫酸钠在所得混合物中的浓度为50mmol/L，进行第一纯化，得到纯化产物；
[0011]将所述纯化产物第一分离后，调节所得上清液的pH值为4.7～4.9，加入十二烷基硫酸钠直至十二烷基硫酸钠在所得混合物中的浓度为100mmol/L，进行第二纯化，将所得产物第二分离后，得到波形蛋白。
[0012]优选的，所述第一盐溶液的组成包括：100mmol/L KCl、2mmol/LMgCl2、2mmol/L EDTA、20mmol/L磷酸钾和0.5mmol/L苯甲基磺酰氟，所述第一盐溶液的pH值为6.8。
[0013]优选的，所述猪脑的湿重与所述第一盐溶液的体积之比为(1.8～2)g:(10～20)mL。
[0014]优选的，所述聚乙二醇单辛基苯基醚的质量为所述猪脑湿重的1％。
[0015]优选的，所述第二盐溶液的组成包括：500mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、0.5mmol/L PMSF和50mmol/L Tris
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HCl；所述Tris
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HCl的pH值为7.0。
[0016]优选的，所述第一洗涤的次数为3次，每次洗涤的时间为30min；所述第二洗涤的时间为30min。
[0017]优选的，完成所述第一洗涤和第二洗涤后，还独立包括：将所得洗涤物进行离心分离；所述离心分离的温度为4℃，离心力为10000g，时间为20min。
[0018]优选的，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L。
[0019]优选的，所述第一纯化和第二纯化的时间为60min。
[0020]优选的，所述第一分离和第二分离的温度为4℃，时间为10min，离心力为10000g。
[0021]本专利技术提供了一种波形蛋白的提纯方法，包括以下步骤：将猪脑、第一盐溶液和聚乙二醇单辛基苯基醚混合，进行第一洗涤，得到第一沉淀；将所述第一沉淀重悬于第二盐溶液，进行第二洗涤，得到第二沉淀；将所述第二沉淀与PBS缓冲液混合后，调节所得混合物的pH值为5.1～5.4，加入十二烷基硫酸钠直至十二烷基硫酸钠在所得混合物中的浓度为50mmol/L，进行第一纯化，得到纯化产物；将所述纯化产物第一分离后，调节所得上清液的pH值为4.7～4.9，加入十二烷基硫酸钠直至十二烷基硫酸钠在所得混合物中的浓度为100mmol/L，进行第二纯化，将所得产物第二分离后，得到波形蛋白。
[0022]本专利技术以猪脑为原材料，通过两次盐溶液洗涤去除猪脑中盐溶性蛋白和肌球蛋白(杂蛋白，等电点接近5，通过盐溶液萃取去除)，然后利用pH值小于蛋白质等电点时，阴离子表面活性剂能引起蛋白质沉淀；pH值大于蛋白质等电点时，阳离子表面活性剂才能沉淀蛋白质的原理(波形蛋白等电点为5.05)，调节混合物pH值为5.1～5.4且十二烷基硫酸钠(SDS)浓度为50mmol/L，然后调节所得上清液pH值为4.7～4.9且SDS浓度100mmol/L，得到波形蛋白。本专利技术利用等电点和十二烷基硫酸钠(SDS)法实现了波形蛋白的分离纯化。
[0023]本专利技术的方法无需过柱，分离程序简便，提纯时间短，原材料易得且量足，解决了市本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种波形蛋白的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：将猪脑、第一盐溶液和聚乙二醇单辛基苯基醚混合，进行第一洗涤，得到第一沉淀；将所述第一沉淀重悬于第二盐溶液，进行第二洗涤，得到第二沉淀；将所述第二沉淀与PBS缓冲液混合后，调节所得混合物的pH值为5.1～5.4，加入十二烷基硫酸钠直至十二烷基硫酸钠在所得混合物中的浓度为50mmol/L，进行第一纯化，得到纯化产物；将所述纯化产物第一分离后，调节所得上清液的pH值为4.7～4.9，加入十二烷基硫酸钠直至十二烷基硫酸钠在所得混合物中的浓度为100mmol/L，进行第二纯化，将所得产物第二分离后，得到波形蛋白。2.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述第一盐溶液的组成包括：100mmol/L KCl、2mmol/L MgCl2、2mmol/L EDTA、20mmol/L磷酸钾和0.5mmol/L苯甲基磺酰氟，所述第一盐溶液的pH值为6.8。3.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述猪脑的湿重与所述第一盐溶液的体积之比为(1.8～2)g:(10～20)mL。4.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶蜜，高翔，方成，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：