一种mTOR抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是涉及一种mTOR抑制剂及其应用。所述mTOR抑制剂为ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸中的第14、17、18位的天冬氨酸均突变为丙氨酸所获得，30个氨基酸的序列如SEQ ID NO:1所示。利用新型邻近标记技术筛选方法找到了ATP6AP1蛋白的C端片段(C tail)作为Rheb的鸟苷酸交换因子(GEF)可激活Rheb，在此基础上，将C末端30个氨基酸中第14、17、18位的天冬氨酸均突变为丙氨酸，获得新的mTOR抑制剂，该mTOR抑制剂可结合并阻断内源性ATP6AP1对Rheb的抑制，进而抑制mTORC1信号通路。通路。通路。

【技术实现步骤摘要】
一种mTOR抑制剂及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种mTOR抑制剂及其应用。

技术介绍

[0002]mTOR(mechanistic mammalian target of rapamycin)，是哺乳类等动物的参与细胞内信号传递的蛋白激酶的一种，其在蛋白质转译、细胞自噬、免疫调节、细胞骨格调节、基因转录等发挥重要作用，与细胞成长、分裂及死亡等基本生命现象密切相关。mTOR，已知是作为表现出强效免疫抑制作用及抗癌作用的雷帕霉素的细胞内标靶而被发现的蛋白质，且是分子量29万的巨大丝氨酸
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苏氨酸激酶。
[0003]目前mTOR抑制剂已有广泛研究，但作为化疗药物，其适用均存在不同的缺陷。mTOR抑制剂的发展大致可分为三种阶段，首先是最早发现的雷帕霉素，但因为它们仅部分阻断4E
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BP依赖性翻译途径，并且不能抑制mTORC2
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Akt调节的促生存途径，同时仅对于肾癌细胞有疗效，因此临床上治疗效果并不理想。第二代药物(Torin1，PP242,Ku
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0063794)主要依靠与ATP竞争占据激酶活性位点抑制mTORC1和mTORC2底物发挥作用。但早期临床数据表明催化mTOR抑制剂会出现耐药性。第三代药物主要是依靠联合用药，使用PI3K和mTOR双重抑制发挥作用。而利用蛋白抑制mTOR，进而治疗肿瘤的用药策略至今尚未被开发。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种mTOR抑制剂及其应用，本专利技术通过新型邻近标记技术筛选方法，找到了ATP6AP1蛋白的C端片段(C tail)作为Rheb的鸟苷酸交换因子(GEF)可激活Rheb，在此基础上，将C末端30个氨基酸中第14、17、18位的氨基酸进行突变，其突变体可结合并阻断内源性ATP6AP1对Rheb的抑制，进而抑制mTORC1信号通路。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0006]第一目的，本专利技术提供了一种mTOR抑制剂，所述mTOR抑制剂为ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸中的第14、17、18位的天冬氨酸均突变为丙氨酸所获得，30个氨基酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]本专利技术通过新型邻近标记技术筛选方法，找到了ATP6AP1蛋白，将C末端30个氨基酸中的第14、17、18位的天冬氨酸均突变为丙氨酸，获得抑制Rheb
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mTORC1的短肽(mTOR抑制剂)，抑制mTORC1信号通路。
[0008]由于mTORC1、mTORC2复合物均含有mTOR蛋白，而Rheb为mTORC1特有。传统直接靶向mTOR的抑制剂，能同时抑制mTORC1、mTORC2下游信号，而本专利技术获得的mTOR抑制剂并不影响mTORC2下游。
[0009]更优选地，mTOR抑制剂为mTORC1抑制剂。
[0010]第二目的，本专利技术提供了ATP6AP1蛋白突变体在抑制mTOR信号通路活性中的应用，其特征在于，ATP6AP1蛋白突变体为ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸中的第14、17、18位的
天冬氨酸均突变为丙氨酸所获得，30个氨基酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0011]作为本专利技术所述ATP6AP1蛋白突变体在抑制mTOR信号通路活性中的应用的优选实施方式，mTOR信号通路包括mTORC1信号通路和mTORC2信号通路。
[0012]第三目的，本专利技术提供了一种筛选mTOR抑制剂的方法，包括以下步骤：
[0013]1)构建生物素连接酶与Rheb融合表达载体，将载体转入宿主细胞内，药物筛选稳定表达Rheb蛋白的细胞株，同时构建对照细胞株；
[0014]2)向稳定表达Rheb蛋白的细胞株中加入胰岛素和生物素进行刺激，向对照细胞株中加入生物素刺激，然后进行质谱检测，分析蛋白；
[0015]3)在有/无进行胰岛素刺激条件下，分别将稳定表达Rheb蛋白的细胞株中的富集蛋白扣除(扣除表示为将两组数据中重叠的蛋白去掉，以达到去除对照组干扰的目的)对照细胞株中的富集蛋白，获得有/无进行胰岛素刺激条件下的Rheb邻近蛋白，分析Rheb邻近蛋白，经鸟嘌呤核苷酸交换因子筛选条件，得ATP6AP1蛋白；将ATP6AP1蛋白C末端30个氨基酸中的第14、17、18位的天冬氨酸均突变为丙氨酸，获得mTOR抑制剂。
[0016]更优选地，鸟嘌呤核苷酸交换因子筛选条件包括以下条件：
[0017](1)GEF(鸟嘌呤核苷酸交换因子)与Rheb存在体内外相互作用；
[0018](2)过表达GEF后可以激活mTORC1下游信号通路；
[0019](3)敲低或敲除GEF后，mTORC1下游信号通路活性受到大幅度抑制；
[0020](4)体外实验证明GEF可以直接促进Rheb完成GDP
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GTP转换过程。
[0021]本专利技术通过新型邻近标记技术筛选得到Rheb蛋白激活剂
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ATP6AP1蛋白，ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸可以直接靶向激活Rheb。
[0022]作为本专利技术所述筛选mTOR抑制剂的方法的优选实施方式，胰岛素的浓度为0.9μM，生物素的浓度为50μM。
[0023]胰岛素、生物素选用上述浓度时，使得生长的细胞株可以较好的发挥功能。
[0024]作为本专利技术所述筛选mTOR抑制剂的方法的优选实施方式，刺激的时间为15min。采用上述刺激时间时，可以较为准备的捕捉到GEF蛋白。
[0025]作为本专利技术所述筛选mTOR抑制剂的方法的优选实施方式，生物素连接酶包括生物素连接酶xxID，生物素连接酶与Rheb融合表达载体为HAFlag
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xxID
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Rheb。本专利技术中提到的生物素连接酶不仅限于本专利技术，还可以为本领域中常规使用的生物素连接酶。
[0026]优选地，稳定表达Rheb蛋白的细胞株为HeLa
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xxID
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Rheb稳定表达细胞株，对照细胞株为HeLa
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xxID稳定表达细胞株。
[0027]更优选地，宿主细胞包括HeLa细胞，还可以为其他细胞。
[0028]第四目的，本专利技术提供了一种抑癌药物，包含上述mTOR抑制剂，以及医学上可接受的载体。
[0029]第五目的，本专利技术提供了一种抗衰老药物，包含上述mTOR抑制剂，以及医学上可接受的载体。
[0030]第六目的，本专利技术提供了上述mTOR抑制剂在制备提高由于ATP6AP1蛋白敲低导致的磷酸化药物中的应用。
[0031]第七目的，本专利技术提供了上述mTOR抑制剂在制备抑制mTORC1信号通路的活性而预防和/或治疗癌症、以及抗衰老药物中的应用，所述癌症包括乳腺癌或胰腺癌。
[0032]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种mTOR抑制剂，其特征在于，所述mTOR抑制剂为ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸中的第14、17、18位的天冬氨酸均突变为丙氨酸所获得，30个氨基酸的序列如SEQ ID NO:1所示。2.ATP6AP1蛋白突变体在抑制mTOR信号通路活性中的应用，其特征在于，ATP6AP1蛋白突变体为ATP6AP1蛋白的C末端30个氨基酸中的第14、17、18位的天冬氨酸均突变为丙氨酸所获得，30个氨基酸的序列如SEQ ID NO:1所示。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，mTOR信号通路包括mTORC1信号通路和mTORC2信号通路。4.一种筛选mTOR抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建生物素连接酶与Rheb融合表达载体，将载体转入宿主细胞内，药物筛选稳定表达Rheb蛋白的细胞株，同时构建对照细胞株；2)向稳定表达Rheb蛋白的细胞株中加入胰岛素和生物素进行刺激，向对照细胞株中加入生物素刺激，然后进行质谱检测，分析蛋白；3)在有/无进行胰岛素刺激条件下，分别将稳定表达Rheb蛋白的细胞株中的富集蛋白扣除对照细胞株中的富集蛋白，获得有/无进行胰岛素刺激...

【专利技术属性】
技术研发人员：松阳洲，冯然，刘峰，吴苏，周志芬，李若菲，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：