一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5

【技术实现步骤摘要】
一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的方法


[0001]本专利技术属于生物催化
，具体涉及一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的方法。

技术介绍

[0002]5‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸(5
‑
methylpyrazine
‑2‑
carboxylic acid,MPCA)，分子式为C6H6N2O2，相对分子质量138.12，是一种重要的医药中间体，主要用于合成第二代口服降血糖药物格列吡嗪(Glipizide)，新一代长效降血脂药阿西莫司(Acipimox)和抗结核病的有效药物5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸甲酯(PAE)。同时，5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸也可作为催化剂用于合成金属配合物。
[0003]目前，5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的工业化制备主要采用化学合成法。以2,5
‑
二甲基吡嗪为原料，经高锰酸钾氧化制备5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸。然而由于高锰酸钾的氧化性很强，很大一部分原料被高锰酸钾过度氧化生成副产物2,5
‑
吡嗪二羧酸，导致主产物MPCA收率较低。而且化学合成法还存在能耗高、反应进程难以控制、产物纯化困难和环境污染严重等缺点。
[0004]生物催化法合成MPCA具有底物转化率高、合成工艺简单、副产物少和环境友好的优点，具有广泛的应用前景。研究表明恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)能选择性氧化2,5
‑
二甲基吡嗪生成MPCA。然而存在细胞内源性酶活性低、催化速率慢、产率低和纯化工艺复杂等不足。且由于恶臭假单胞菌中催化合成MPCA的多酶体系为诱导表达，需要在培养液中加入甲苯和二甲苯作为诱导剂，因此存在严重的环境污染和人体毒性。另外，恶臭假单胞菌中还存在降解产物5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的酶系，导致催化产物被消耗。
[0005]通过基因工程技术将恶臭假单胞菌中催化合成MPCA的基因簇在大肠杆菌中进行表达，然后通过重组大肠杆菌催化合成MPCA是一条有效途径。专利CN201910833893.0和CN201711325652.2公开了在大肠杆菌中共表达来源于恶臭假单胞菌的二甲苯单加氧酶(XMO)、苯甲醇脱氢酶(BADH)和苯甲醛脱氢酶(BZDH)，然后通过重组大肠杆菌游离细胞以2,5
‑
二甲基吡嗪为底物催化合成MPCA。但是构建的工程菌活性较低，导致催化反应底物转化率较低，反应时间较长(36
‑
48h)。同时，由于游离细胞机械强度较低，在催化反应中容易破碎裂解，细胞无法重复利用，导致细胞催化剂成本较高，不利于工业化生产。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的方法，给出了能高效可溶性表达二甲苯单加氧酶(XMO)、苯甲醇脱氢酶(BADH)和苯甲醛脱氢酶(BZDH)的重组大肠杆菌构建方法以及大肠杆菌细胞固定化方法，该方法可以高效催化合成5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸。
[0007]本专利技术采用以下技术方案：一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的方法制备方法如下：
[0008]步骤一、利用大肠杆菌BL21(DE3)分别发酵培养表达二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的重组大肠杆菌细胞，离心获得菌体；
[0009]步骤二、将所述菌体重悬后与聚乙烯亚胺和戊二醛混合搅拌混匀，制备固定化重组大肠杆菌细胞；
[0010]步骤三、以2,5
‑
二甲基吡嗪为底物，以所述固定化重组大肠杆菌细胞为催化剂，催化合成5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸。
[0011]进一步地，该二甲苯单加氧酶以pACYCDuet
‑
1为基因表达载体，所述苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶以pETDuet
‑
1为基因表达载体。
[0012]进一步地，该的重组大肠杆菌细胞表达带有类泛素化修饰蛋白(SUMO)标签的二甲苯单加氧酶融合蛋白。
[0013]进一步地，在二甲苯单加氧酶xylA亚基的氨基端融合了类泛素化修饰蛋白(SUMO)标签，或者在xylA和xylM两个亚基的氨基端均融合了SUMO标签。
[0014]进一步地，该步骤二中，所述聚乙烯亚胺的质量浓度为1
‑
5％，戊二醛质量浓度为0.5
‑
3％，重组大肠杆菌菌体添加量为50
‑
300g/L。
[0015]进一步地，该步骤三中的反应温度为25
‑
40℃，固定化大肠杆菌细胞用量为50
‑
200g/L，底物2,5
‑
二甲基吡嗪质量浓度为5
‑
20g/L，转化时间8
‑
24h。
[0016]进一步地，该步骤二中，混合搅拌时间为30
‑
120min。
[0017]本专利技术公开了一种固定化大肠杆菌细胞，采用上述的方法制备而成。
[0018]本专利技术的有益效果是：1.在重组大肠杆菌构建过程中，在二甲苯单加氧酶xylA亚基的氨基端融合了类泛素化修饰蛋白(SUMO)标签，或者在xylA和xylM两个亚基的氨基端均融合了SUMO标签。获得了能高效可溶性表达重组二甲苯单加氧酶的工程菌，与未融合SUMO标签的重组大肠杆菌相比，二甲苯单加氧酶活性提高了7倍。2.使用聚乙烯亚胺和戊二醛对大肠杆菌细胞进行交联制备固定化细胞；使用固定化细胞以2,5
‑
二甲基吡嗪为原料催化合成5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸。大肠杆菌细胞经固定化后结构非常稳定，催化反应八批次后依然能保持其初始酶活性的80％以上，通过固定化大肠杆菌细胞的方法，提高了细胞的在催化体系中的催化活性、耐受性和重复利用率。
附图说明
[0019]图1为苯甲醇脱氢酶(BADH)重组表达及纯化电泳图；
[0020]图2为苯甲醛脱氢酶(BZDH)重组表达及纯化电泳图；
[0021]图3为二甲苯单加氧酶(XMO)重组表达电泳图；
[0022]图4为融合SUMO标签的二甲苯单加氧酶重组表达电泳图；
[0023]图5为三种酶XMO(xylA和xylM两个亚基均融合SUMO标签)、BADH和BZDH共表达电泳图；
[0024]图6为重组XMO、BADH和BZDH三种蛋白可溶性表达电泳图；
[0025]图7为固定化细胞和游离细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的方法，其特征在于，制备方法如下：步骤一、利用大肠杆菌BL21(DE3)分别发酵培养表达二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的重组大肠杆菌细胞，离心获得菌体；步骤二、将所述菌体重悬后与聚乙烯亚胺和戊二醛混合搅拌混匀，制备固定化重组大肠杆菌细胞；步骤三、以2,5
‑
二甲基吡嗪为底物，以所述固定化重组大肠杆菌细胞为催化剂，催化合成5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸。2.如权利要求1所述的一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的方法，其特征在于，所述二甲苯单加氧酶以pACYCDuet
‑
1为基因表达载体，所述苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶以pETDuet
‑
1为基因表达载体。3.如权利要求2所述的一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的方法，其特征在于，所述的重组大肠杆菌细胞表达带有类泛素化修饰蛋白(SUMO)标签的二甲苯单加氧酶融合蛋白。4.如权利要求3所述的一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5
‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸的方法，其特征在于，在二甲苯单加...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛卫宁，武彦君，王军，李恒，贾冠雅，何伟娟，朱志龙，王晶，甘海胜，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：