一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法。本发明专利技术通过基因工程手段改造大肠杆菌，构建了两条新的生物催化级联,利用多巴胺、木质纤维素衍生的对香豆酸及其类似物高效合成包含(S)

【技术实现步骤摘要】
一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法


[0001]本专利技术属于生物催化剂领域，具体涉及一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法。

技术介绍

[0002]苄基异喹啉生物碱(BIAs)是植物特有的代谢物，由约2500个化合物组成一个大家族。这些化合物因具备多种生物活性，如抗菌、抗炎、抗病毒和抗疟原虫活性而受到越来越多的关注。典型的BIAs，如诺司卡平、吗啡和罂粟碱分别被用作咳嗽抑制剂、麻醉止痛剂和肌肉松弛剂。此外，一些BIAs被确定为针对新病毒SARS
‑
CoV
‑
2的进入抑制剂，而SARS
‑
CoV
‑
2是导致2019年冠状病毒病(COVID
‑
19)的主要因素。因此，生物碱的有效合成具有重要的意义。
[0003]工业上，BIAs的合成还主要依赖于从植物组织中提取或者化学合成的方法。然而，传统的提取方法存在一些局限性，包括效率低、成本高、耗时长，而化学合成也面临挑战，例如结构复杂性和不利于环境的试剂的使用。另外，合成生物学的快速发展为合成BIAs提供了新的思路。最常用的方法是通过在微生物(如酿酒酵母或大肠杆菌)中构建异源途径，将单糖作为起始材料的从头合成。该方法旨在模拟植物中的自然生物合成途径，但这些途径往往涉及多步反应、多个酶，从而造成较低的合成效率。此外，体外酶级联的方法也是近年来较为常用的手段。该方法通常以L
‑
酪氨酸衍生物为底物，在产物产量和立体选择性方面表现出了巨大的潜力。但该方法涉及多个酶的纯化与制备，往往需要较高的成本。化学酶级联为合成复杂的BIAs提供了另一种方法，尤其是具有高立体选择性的BIAs，但该方法通常面临着化学和酶转化所需条件的不相容性的挑战。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法。本专利技术通过构建生物催化级联催化对香豆酸衍生物和多巴胺合成苄基异喹啉生物碱。
[0005]本专利技术通过基因工程手段改造大肠杆菌，构建了两条新的生物催化级联，利用多巴胺、木质纤维素衍生的对香豆酸及其类似物高效合成包含(S)
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去甲乌药碱及(S)
‑
全去甲劳丹碱在内的多种苄基异喹啉生物碱，产物具备很好的对映选择性(≥98％ee)，多数的浓度大于1g
·
L
‑1。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下方案来实现：
[0007]本专利技术提供了一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法，所述方法包括如下步骤：
[0008]S1、对大肠杆菌进行改造，构建脱羧
‑
环氧
‑
异构
‑
缩合的生物催化级联，获得生物催化剂；
[0009]S2、以多巴胺与对香豆酸或其衍生物为催化底物，通过生物催化剂合成苄基异喹
啉生物碱。
[0010]作为本专利技术的一个实施方案，所述对香豆酸衍生物包括阿魏酸、咖啡酸、肉桂酸、3
‑
羟基肉桂酸、3
‑
甲基肉桂酸、3
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甲氧基肉桂酸、4
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甲氧基肉桂酸、3,4
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二甲氧基肉桂酸中的一种。
[0011]作为本专利技术的一个实施方案，所述苄基异喹啉生物碱包括(S)
‑
去甲乌药碱、(S)
‑
全去甲劳丹碱、(S)
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1、(S)
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2、(S)
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3、(S)
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4、(S)
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5、(S)
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6、(S)
‑
7；
[0012][0013](S)
‑
7结构式如下：
[0014][0015]作为本专利技术的一个实施方案，所述生物催化级联脱羧
‑
环氧
‑
异构
‑
缩合的构建是通过在E.coli中过表达来源于Bacillus licheniformis CGMCC7172的脱羧酶BLPad、来源于Pseudomonas sp.strain VLB120的苯乙烯单加氧酶StyAB、来源于Rhodococcus opacus 1CP的环氧化物异构酶RostyC、来源于Thalictrum flavum的去甲乌药碱合成酶突变体Δ29TfNCS、来源于Aspergillus niger的脱羧酶AnPad(编码基因为fdc和pad)中的一种或多种实现。本专利技术使用的酶是已知的酶，可以通过文献报道或者NCBI中获得。本专利技术通过在大肠杆菌内过表达脱羧酶、苯乙烯单加氧酶、环氧化物异构酶以及去甲乌药碱合成酶中一种或多种，构建脱羧
‑
环氧
‑
异构
‑
缩合的催化级联，制得生物催化剂。
[0016]此过程中，构建四个生物催化剂ZMTS 1
‑
4催化多巴胺和对香豆酸合成(S)
‑
去甲乌药碱，选出最优的生物催化剂进一步催化多巴胺和咖啡酸合成(S)
‑
全去甲劳丹碱，催化多巴胺和阿魏酸合成一种非天然苄基异喹啉生物碱；构建生物催化剂ZMTS 5催化多巴胺和对香豆酸衍生物(肉桂酸、3
‑
羟基肉桂酸、3
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甲基肉桂酸、3
‑
甲氧基肉桂酸、4
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甲氧基肉桂酸以及3,4
‑
二甲氧基肉桂酸)成功地合成了6种非天然的苄基异喹啉生物碱。
[0017]作为本专利技术的一个实施方案，所述催化剂是将质粒pET28a
‑
StyAB
‑
RostyC
‑7‑
BLPad、pA7a
‑
Δ29TfNCS、pB7c
‑
Δ29TfNCS、pET28a
‑
StyAB
‑
RostyC、pA7a
‑
BLPad
‑7‑
Δ29TfNCS、pB7c
‑
BLPad
‑7‑
Δ29TfNCS、pET28a
‑
StyAB
‑
RostyC
‑7‑
AnPad和pA7a
‑
Δ29TfNCS中的两个结合导入大肠杆菌构建所得。质粒pET28a
‑
StyAB
‑
RostyC
‑7‑
BLPad中7表示T7启动
子，在blpad基因前添加T7启动子。质粒pB7c
‑
BLPad
‑7‑
Δ29TfNCS中7表示T7启动子，在Δ29TfNCS基因前添加T7启动子。质粒pET28a
‑
StyAB
‑
RostyC
‑7‑
AnPad本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、对大肠杆菌进行改造，构建脱羧
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环氧
‑
异构
‑
缩合的生物催化级联，获得生物催化剂；S2、以多巴胺和对香豆酸或其衍生物为催化底物，通过生物催化剂合成苄基异喹啉生物碱。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对香豆酸衍生物包括阿魏酸、咖啡酸、肉桂酸、3
‑
羟基肉桂酸、3
‑
甲基肉桂酸、3
‑
甲氧基肉桂酸、4
‑
甲氧基肉桂酸、3,4
‑
二甲氧基肉桂酸中的一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苄基异喹啉生物碱包括(S)
‑
去甲乌药碱、(S)
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全去甲劳丹碱、(S)
‑
1、(S)
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2、(S)
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3、(S)
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4、(S)
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5、(S)
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6、(S)
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7；(S)
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7结构式如下：4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱羧
‑
环氧
‑
异构
‑
缩合的生物催化级联的构建是通过在E.coli中过表达来源于Bacillus licheniformis CGMCC7172的脱羧酶BLPad、来源于Pseudomonas sp.strain VLB120的苯乙烯单加氧酶StyAB、来源于Rhodococcus opacus 1CP的环氧化物异构酶RostyC、来源于Thalictrum flavum的去甲乌药碱合成酶突变体Δ29TfNCS、来源于Aspergillus niger的脱羧酶AnPad中的一种或多种实现。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化剂是将质粒pET28a
‑
StyAB
‑
RostyC
‑7‑
BLPad、pA7a
‑
Δ29TfNCS、pB7c
‑
Δ29TfNCS、pET28a
‑
StyAB
‑
RostyC、pA7a
‑
BLPad
‑7‑
Δ29TfNCS、pB7c
‑
BLPad
‑7‑
Δ29TfNCS、pET28a
‑
StyAB
‑
RostyC
‑7‑
AnPad和pA7a
‑
Δ29TfNCS中的两个结合导入大肠杆菌构建所得。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述质粒pET28a
‑
StyAB
‑
RostyC
‑7‑
BLPad是将BLPad、StyAB和RostyC通过酶切连接进入载体pET28a构建所得；所述质粒pET28a
‑
StyAB
‑
RostyC是将StyAB和RostyC通过酶切连接进入载体pET28a构建所得；所述质粒pA7a
‑
Δ29TfNCS是将Δ29TfNCS通过酶切连接进入载体pA7a构建所得；所述质粒pB7c
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Δ29TfNCS是将Δ29TfNCS通过酶切连接进入载体pB7c构建所得；所述质粒pA7a...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖毅，赵明涛，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：