一种生物转化合成5-氟尿嘧啶的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物转化合成5

【技术实现步骤摘要】
一种生物转化合成5
‑
氟尿嘧啶的方法


[0001]本专利技术属于医药合成中生物发酵
，涉及5
‑
氟尿嘧啶的生物合成，具体涉及利用密西根克雷伯氏菌合成5
‑
氟尿嘧啶的方法。

技术介绍

[0002]克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性杆菌，主要包括肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhino scleromatis)。生物学性状：为较短粗的杆菌，大小0.5
‑
0.8
×1‑
2um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。
[0003]具有O抗原与K抗原，后者用以分型。利用荚膜肿胀试验，本属K抗原可分为82型。肺炎克氏菌大多属3型和12型；臭鼻克氏菌主要属4型，少数为5型或6型；鼻硬结克氏菌一般属3型，但并非所有3型均为该菌。本属细菌在55℃、30分钟内被杀死，在培养基上可存活数周至数月。
[0004]5‑
氟尿嘧啶为抗嘧啶类药物，为白色或类白色的结晶或结晶性粉末。须经过酶转化为5
‑
氟脱氧尿嘧啶核苷酸而具有抗肿瘤活性，通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成。此酶的作用可能把甲酰四氢叶酸的一碳单位也转移给脱氧尿嘧啶核苷酸一磷酸合成胸腺嘧啶核苷一酸。同时对RNA的合成也有一定抑制作用。临床上用于多种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌等的治疗有效，尤对消化道癌及其他实体瘤有良好疗效，可静脉或腔内注射，口服吸收不完全。其合成方法主要为化学合成法，采用生物合成从5
‑
氟胞嘧啶直接转化为5
‑
氟尿嘧啶仍然没有突破性进展。

技术实现思路

[0005]为了克服上述缺陷，本专利技术工艺采用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将5
‑
氟胞嘧啶转化为5
‑
氟尿嘧啶，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。
[0006]本专利技术技术方案转化过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取等四个过程。详细工艺流程见附图1。
[0007]微生物信息：本专利技术所采用密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为以及具体实施方式所使用的密西根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.16111。
[0008]保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年07月16日。
[0009]一、菌体制备
[0010]1.1菌体活化及产酶培养
[0011]菌种：Klebsiella michiganensis(密西根克雷伯氏菌)
[0012]菌株保藏号：CGMCC16111
[0013]活化培养基：酵母膏15g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨20g/L、pH7.0；
[0014]培养条件：38℃，200rpm，12h；
[0015]菌体发酵培养基：酵母膏150g/L、玉米浆50g/L、氯化钠15g/L、氯化铵10g/L、氯化钙0.8g/L、硫酸镁0.6g/L、硫酸锰0.8g/L、pH7.0；
[0016]培养条件：38℃，DO≥20％，12
‑
24h；
[0017]1.2菌体收集
[0018]产酶培养液微滤的湿菌体溶液，用pH＝7.0、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤一次，离心所得湿菌体
‑
20℃冷冻保存备用。
[0019]二、固定化酶制备
[0020]2.1提酶
[0021]利用超声波细胞破碎法处理菌悬液，离心上清即酶液。
[0022]超声处理条件：菌悬液配方：Tris
‑
Hcl 50mN、EDTA5mN、pH＝8.0、菌体浓度60％
[0023]破碎条件：1600W、35℃、30min
[0024]离心条件：7000rpm、30min
[0025]2.2活化树脂
[0026](1)水洗
[0027]称量适量的新树脂用纯化水洗至无混浊(5
‑
8次)，然后抽滤后用适量PBS缓冲液浸泡5
‑
10h。
[0028](2)戊二醛交联
[0029]抽滤除掉PBS缓冲液，然后加入10倍体积0.5％戊二醛溶液，25℃水浴搅拌12
‑
15h。
[0030](3)水洗
[0031]交联后树脂抽滤除去戊二醛溶液，然后用纯化水洗干净后待用。
[0032]2.3酶联
[0033]活化树脂与酶量按照1:1.5比例混匀，20℃水浴搅拌12
‑
15h，然后水洗至中性待用。
[0034]三、酶促反应
[0035]3.1反应体系配制
[0036]5‑
氟胞嘧啶50
‑
250g/L；固定化酶量10
‑
100g/L；
[0037]反应体系：纯化水
[0038]3.2反应条件
[0039]待反应体系配制完成后，将反应温度控制在45
‑
65℃范围内，控制搅拌速度为100
‑
200rpm反应12
‑
24h，然后抽滤得合成液，待进行目的产物提取工序。
[0040]四、产品提取
[0041]4.1粗品制备
[0042]酶促反应结束后，抽滤得到5
‑
氟尿嘧啶合成液，旋蒸浓缩，降温结晶抽滤得到5
‑
氟尿嘧啶粗品。
[0043]4.2粗品精制
[0044]检测5
‑
氟尿嘧啶粗品中产物含量，按照粗品中5
‑
氟尿嘧啶含量采用适量碱和乙醇/水热溶，抽滤后得精品溶液，然后降温结晶、抽滤或离心得5
‑
氟尿嘧啶湿品。
[0045]4.3产品干燥
[0046]将5
‑
氟尿嘧啶湿品干燥后进行质量检验，检验合格后即5
‑
氟尿嘧啶成品。
[0047]进一步地，在上述技术方案中，该工艺反应体系为纯化水，以5
‑
氟胞嘧啶为底物一步合成目标产物5
‑
氟尿嘧啶，成本低廉环保易操作适合工业化。
[0048]进一步地，在上述技术方案中，提取工序中，该工艺该工艺产物积累浓度最高达1mol/L以上，固定化酶与反应液易分离，产物易提取，收率高(≥95％)。
[0049]专利技术有益效果
[0050]1菌种
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用密西根克雷伯氏菌合成5
‑
氟尿嘧啶的方法，其特征在于：以5
‑
氟胞嘧啶为原料，利用密西根克雷伯氏菌转化合成5
‑
氟尿嘧啶。2.根据权利要求1所述合成5
‑
氟尿嘧啶的方法，其特征在于：所述密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为Klebsiella michiganensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16111。3.根据权利要求1所述合成5
‑
氟尿嘧啶的方法，其特征在于：转化合成过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取。4.根据权利要求3所述合成5
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氟尿嘧啶的方法，其特征在于：菌体制备包括菌体活化、产菌培养和菌体收集。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨邵华，邢善涛，李涛，王德地，王东琨，靳海燕，柳芳，
申请(专利权)人：新乡制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：