一种生物转化合成尿苷的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物转化合成尿苷的方法，属于生物发酵技术领域。该工艺利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将肌苷和尿嘧啶一步转化为尿苷。与其他工艺相比，本发明专利技术反应体系为纯化水、合成液中各个组分明确，利用该方法得到的尿苷易提取，产品质量高，成本低廉且易操作适合工业化，成品含量≥99.9％，具有明显市场竞争力。具有明显市场竞争力。

【技术实现步骤摘要】
一种生物转化合成尿苷的方法


[0001]本专利技术属于医药合成中生物发酵
，涉及尿苷的生物合成，具体涉及利用密西根克雷伯氏菌合成尿苷的方法。

技术介绍

[0002]克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性杆菌，主要包括肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhino scleromatis)。生物学性状：为较短粗的杆菌，大小0.5
‑
0.8
×1‑
2um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。
[0003]具有O抗原与K抗原，后者用以分型。利用荚膜肿胀试验，本属K抗原可分为82型。肺炎克氏菌大多属3型和12型；臭鼻克氏菌主要属4型，少数为5型或6型；鼻硬结克氏菌一般属3型，但并非所有3型均为该菌。本属细菌在55℃、30分钟内被杀死，在培养基上可存活数周至数月。
[0004]尿苷，白色针状结晶或粉末，属于核苷类化合物，由尿嘧啶与核糖(呋喃核糖)环组成，两者由β
‑
N1
‑
配糖键相连。尿苷作为一种药物，如抗巨型红血球贫血，治疗肝、脑血管、心血管等疾病，也是制造氟尿嘧啶(S
‑
FC)、脱氧核苷、碘苷(IDUR)、溴苷(BUDR)、氟苷(FUDR)等药物的主要原料。其合成方法主要为化学合成法，采用生物合成从肌苷和尿嘧啶直接转化为尿苷仍然没有突破性进展。

技术实现思路

[0005]为了克服上述缺陷，本专利技术工艺采用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将肌苷和尿嘧啶直接转化为尿苷，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。
[0006]本专利技术技术方案转化过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取等四个过程。详细工艺流程见附图1。
[0007]微生物信息：本专利技术所采用密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为以及具体实施方式所使用的密西根克雷伯氏菌(Klebsiellamichiganensis)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.16111。
[0008]保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年07月16日。
[0009]一、菌体制备
[0010]1.1菌体活化及产酶培养
[0011]菌种：Klebsiellamichiganensis(密西根克雷伯氏菌)
[0012]菌株保藏号：CGMCC16111
[0013]活化培养基：酵母膏15g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨20g/L、pH＝7.0；
[0014]培养条件：38℃，200rpm，12h；
[0015]菌体发酵培养基：酵母膏150g/L、玉米浆50g/L、氯化钠15g/L、氯化铵10g/L、氯化钙0.8g/L、硫酸镁0.6g/L、硫酸锰0.8g/L、pH＝7.0；
[0016]培养条件：38℃，DO≥20％，12
‑
24h；
[0017]1.2菌体收集
[0018]将菌体培养液离心处理(5000rpm离心10min)，然后湿菌体用pH＝7.0、20mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤一次，离心所得湿菌体
‑
20℃冷冻保存备用。
[0019]二、生物转化反应
[0020]2.1反应体系配制
[0021]肌苷100
‑
600mmol/L；尿嘧啶100
‑
600mmoL/L；湿菌体5
‑
20g/L；
[0022]反应体系：纯化水
[0023]2.2反应条件
[0024]待反应体系配制完成以后200rpm搅拌，45
‑
65℃水浴反应24
‑
48h，然后微滤得生物转化合成液，进行下一步提取工序。
[0025]三、产品提取
[0026]3.1粗品溶液制备
[0027]转化反应结束后，微滤得合成液，旋蒸浓缩后，根据尿苷含量加入适量无水乙醇热溶后抽滤得尿苷粗品溶液。
[0028]3.2浓缩结晶
[0029]将粗品溶液加入适量活性炭后抽滤、降温结晶，然后离心或抽滤得尿苷湿品。
[0030]3.3产品干燥
[0031]将离心或抽滤得到得尿苷湿品80
‑
100℃干燥后得尿苷检验合格后，包装得尿苷成品。
[0032]进一步地，在上述技术方案中，该工艺反应体系为纯化水，以肌苷和尿嘧啶为底物一步合成目标产物尿苷，成本低廉环保易操作适合工业化。
[0033]进一步地，在上述技术方案中，提取工序中，该工艺中产物积累浓度最高达360mmol/L以上，固定化酶与反应液易分离，产物易提取，收率高。
[0034]专利技术有益效果
[0035]1菌种
[0036]该工艺首次利用Klebsiellamichiganensis(密西根克雷伯氏菌)湿菌体细胞生物转化肌苷和尿嘧啶一步合成尿苷，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。
[0037]2反应体系
[0038]该工艺使用的反应体系为纯化水，以肌苷和尿嘧啶为底物生物转化合成目的产物尿苷，成本低廉、环保、易操作适合工业化。
[0039]3生产效率高且环保
[0040]利用该工艺生产尿苷，底物转化率达到90％以上，底物肌苷浓度高达400mmol/L以上，产物积累浓度最高达360mmol/L以上，反应周期短，产物易分离，成本低且环保，易于产业化。
附图说明
[0041]图1为生物法合成尿苷工艺流程图；
[0042]图2为温度对菌体生长和菌体活性的影响；
[0043]图3为pH值对菌体生长和活力的影响；
[0044]图4为培养时间对菌体生长的影响；
[0045]图5为温度对底物转化率的影响；
[0046]图6为pH值对转化率的影响；
[0047]图7为不同底物配比对肌苷转化率的影响；
[0048]图8为底物浓度与转化率关系曲线；
[0049]图9为反应时间对底物转化率的影响；
[0050]图10为湿菌体量对底物转化率的影响。
具体实施例
[0051]实施例1
[0052]生物转化合成尿苷条件优化
[0053]1菌体培养条件优化
[0054]1.1最适培养温度的确定
[0055]将培养20h种子培养液按5％接种量接种于菌体发酵培养基中，DO≥20％条件下，分别在28
‑
42℃温度范围不同温度条件下培养20h，测定菌体浓度和活力(图2)。结果显示，在28
‑
38℃培养温度范围内菌体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用密西根克雷伯氏菌合成尿苷的方法，其特征在于：以肌苷和尿嘧啶为原料，利用密西根克雷伯氏菌转化合成尿苷。2.根据权利要求1所述合成尿苷的方法，其特征在于：所述密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为Klebsiella michiganensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16111。3.根据权利要求1所述合成尿苷的方法，其特征在于：转化合成过程包括：菌体制备、生物转化反应和产品提取。4.根据权利要求3所述合成尿苷的方法，其特征在于：菌体制备包括菌体活化、产...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨邵华，邢善涛，李涛，王德地，谷艳昌，王东琨，柳芳，
申请(专利权)人：新乡制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：