一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法技术

本发明专利技术提供一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，通过将来源于新喀里多尼亚弧菌的ectABC基因簇，导入表达载体pBAD中，构成重组表达载体pBADVnectABC，并对重组菌株用L

【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法


[0001]本专利技术涉及基因工程和生物
，特别涉及一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法。

技术介绍

[0002]四氢嘧啶(ectoine，Ec)，是一种源于嗜盐具有渗透调节功能的相容性溶质，其作用是帮助嗜盐微生物维持细胞质与环境的渗透平衡。四氢嘧啶不仅是微生物细胞的渗透压调节物质，还是细胞及大分子物质的生物保护剂，可缓解高渗、高温、冻融、干燥、辐射和化学试剂对蛋白、核酸、生物膜及整个细胞的毒害作用。由于四氢嘧啶是所有己知的相容性溶质中对生物细胞及大分子物质保护效果最好的化合物，所以近年来它在医疗、酶工业、化妆品等领域的应用也日益受到关注。
[0003]目前获取四氢嘧啶的方法之一是通过嗜盐微生物发酵以获得大量四氢嘧啶。但从嗜盐微生物中分离纯化四氢嘧啶，则需要粉碎菌体或浸泡溶胀使四氢嘧啶释放出来，同时菌体破碎后产生的蛋白等杂质也增加了下游纯化的工艺。近年来，有专利通过重组大肠杆菌生产四氢嘧啶，且四氢嘧啶主要在发酵液中，但此专利采用双膜系统提取四氢嘧啶，此种方法虽然能耗较低，但菌体和蛋白很容易将膜孔径堵塞，大大缩短了膜的使用寿命，不符合实际生产的经济性。专利CN202011343592.9一种双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法，是从一种嗜盐菌体中分离纯化四氢嘧啶的方法，而通过嗜盐微生物在高盐浓度下发酵对设备损耗较大，而且提高了生产成本。专利201310518176.1一种四氢嘧啶高产大肠杆菌工程菌及其应用，生物转化反应后需要进行胞内/胞外四氢嘧啶的抽提，而其需要分别对胞内和胞外进行反复水相的抽提处理，其操作复杂且蛋白等杂质去除不充分，得率低等不足。因此，本专利技术寻求一种新的重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，以实现更加简化的纯化工艺，获得高收率、高纯度的四氢嘧啶成品。

技术实现思路

[0004]鉴以此，本专利技术提出一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，不仅可在低盐环境下生产四氢嘧啶，而且实现了更加简便的四氢嘧啶纯化工艺，安全环保，成本低，四氢嘧啶的纯度高达95.6％，收率达72％。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，包括如下步骤：
[0007](1)生产四氢嘧啶：将来源于新喀里多尼亚弧菌的ectABC基因簇，通过酶切、连接导入到表达载体pBAD，构成重组表达载体pBADVnectABC，并导入大肠杆菌BW25113，构成重组菌株K
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VnectABC(菌种保藏号：GDMCCNo.61577，于中国广东省的GDMCC
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广东省微生物菌种保藏中心，EscherichiacoliK
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VnectABC菌种保藏日期为2021年3月24日)；重组菌株用L
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阿拉伯糖诱导VnectABC的表达，离心收集细胞，加入含有天冬氨酸钠、甘油和氯化钾的PBS缓冲液中，形成细胞悬浮液，进行全细胞催化，生产四氢嘧啶；
[0008](2)纯化四氢嘧啶：将全细胞催化完成后的发酵液离心，收集上清，加入氯仿
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正丁醇混匀，剧烈震荡，离心，取水相；将水相进行减压浓缩，并调节pH 至4.5～5.5后，经聚酰胺吸附纯化，乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩结晶处理，得到高纯度的四氢嘧啶成品，相比现有的四氢嘧啶生产及纯化技术(如膜系统过滤、电渗析法脱盐、活性炭脱色等方法)，本专利技术具有操作简便，安全环保，成本低、收率高、产品纯度高等优点，适合工业推广应用。
[0009]进一步说明，所述ectABC基因簇是由新喀里多尼亚弧菌中通过PCR克隆四氢嘧啶合成的基因簇ectABC，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1
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4所示，其中，序列表SEQ ID NO.2
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3依次为VnectA、VnectB和VnectC。
[0010]更优选的，步骤(1)中每100mM的PBS缓冲液中含有100mM天门冬氨酸钠、100mM氯化钾和100mM甘油，pH为7.0～7.5，温度为28℃。
[0011]更优选的，所述细胞悬浮液在28～32℃，180～220rpm条件下进行催化反应 24小时，生产四氢嘧啶。
[0012]更优选的，步骤(2)中，所述上清、氯仿与正丁醇按照体积比为(22～28): (3～5):1混合，并剧烈震荡25～35分钟。
[0013]更优选的，步骤(2)中，所述水相减压浓缩至原体积的20％，调节pH至 5.0，经聚酰胺树脂纯化，流速为1.8～2.2BV/h，由质量浓度为60％乙醇溶液洗脱，流速为0.6～1.5BV/h，收集洗脱液。
[0014]更优选的，所述聚酰胺树脂的目数为14～30目。
[0015]进一步说明，所述重组表达载体pBADVnectAB在大肠杆菌中的重组表达方法，具体为：
[0016](1)在含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下接种含有重组表达载体 pBAD Vn ectABC的阳性克隆过夜；
[0017](2)取过夜适量培养物按比例1:100加入LB培养基，在37℃下培养3小时，使其O6
600
＝0.6；
[0018](3)将L
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阿拉伯糖添加到细菌培养物中使其终浓度为0.1％，在30℃，220 rpm诱导8h后，离心收集细胞。
[0019]更优选的，步骤(1)中，在加入PBS缓冲液前，采用0.85％NaCl溶液洗涤两次。
[0020]更优选的，所述浓缩结晶处理为：将洗脱液浓缩至浓度为50％，从50℃开始降温结晶至
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4℃结晶结束，将粗晶再次重溶于质量浓度为60％乙醇溶液中，滤去杂质，重复浓缩结晶、干燥，得到高纯度的四氢嘧啶成品。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术通过采用新喀里多尼亚弧菌的ectABC基因簇，进行表达载体的构建，并对重组大肠杆菌在L
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阿拉伯糖诱导VnectABC的表达的基础上，采用含有天冬氨酸钠、甘油和氯化钾的PBS缓冲液来制备细胞悬浮液，不需要添加葡萄糖下，即可进行全细胞催化生产四氢嘧啶，实现在低盐环境下有效生产四氢嘧啶；并通过优化了发酵液四氢嘧啶的纯化工艺，对发酵上清液采用氯仿
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正丁醇进行提取联合酸性条件下的聚酰胺吸附处理，结合乙醇洗脱，洗脱液无酸碱度变化，无需进行分段上清的收集，洗脱液收集方便，所获得的四氢嘧啶的得率和纯度显著提高，在实际生产过程中的生产周期大幅缩短，具有操作简便、生产成本低、产品得率高、产品纯度品质优异的特点，四氢嘧啶的纯度高达95.6％，收率达72％，安全环保，适合工业推广应用。
附图说明
[0022]图1本专利技术实施例3的pBADectABC重组表达SDS
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PAGE鉴定分析电泳图；
[0023]图2本专利技术实施例高效液相检测四氢嘧啶谱图(四氢嘧啶标准品)；
[0024]图3本专利技术实施例高效本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)生产四氢嘧啶：将来源于新喀里多尼亚弧菌的ectABC基因簇，通过酶切、连接导入到表达载体pBAD中，构成重组表达载体pBADVnectABC，并导入大肠杆菌BW25113，构成重组菌株K
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VnectABC，该菌种的保藏号为：GDMCC No.61577；重组菌株用L
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阿拉伯糖诱导VnectABC的表达，离心收集细胞，加入含有天冬氨酸钠、甘油和氯化钾的PBS缓冲液中，形成细胞悬浮液，进行全细胞催化，生产四氢嘧啶；(2)纯化四氢嘧啶：将全细胞催化完成后的发酵液离心，收集上清，加入氯仿
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正丁醇混匀，剧烈震荡，离心，取水相；将水相进行减压浓缩，并调节pH至4.5～5.5后，经聚酰胺吸附纯化，乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩结晶处理，得到高纯度的四氢嘧啶成品。2.如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：所述ectABC基因簇是由新喀里多尼亚弧菌中通过PCR克隆四氢嘧啶合成的基因簇ectABC，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1
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4所示。3.如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：步骤(1)中每100mM的PBS缓冲液中含有100mM天门冬氨酸钠、100mM氯化钾和100mM甘油，pH为7.0～7.5，温度为28℃。4.如权利要求3所述的一种重组大肠杆菌生产四氢嘧啶及纯化方法，其特征在于：所述细胞悬浮液在28～32℃，180～220rpm条件下进行催化反应24小时，生产四氢嘧啶。5.如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭琳，康由发，杨茜雅，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院海口实验站，
类型：发明
国别省市：