一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法及试剂盒技术

本发明专利技术属于激素检测技术领域，涉及一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法及试剂盒。针对现有高效液相色谱串联质谱技术检测血清中的ADS、DHEA和DHEAS时，对于多组分的测定需要大量的样品量和时间，且缺乏高质量游离态激素的测定手段，对由游离态激素的测定大多使用间接测试，基本手段为测量总激素以及蛋白总量，然后利用质量方程对游离态激素进行理论估算，其准确度不足，操作麻烦等技术问题，本申请提供一种同时检测血清中三种游离雄激素含量的方法，具有检出限低、准确度高、重现性好、耗时短的优点。本申请还提供了一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，仅需300μL血清样品即可实现检测，操作快速简便。操作快速简便。操作快速简便。

【技术实现步骤摘要】
一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于激素检测
，具体地，涉及一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]无论是成人，还是青少年和新生儿，类固醇激素的定量测定对于评估肾上腺和性腺功能、鉴别诊断和治疗药物监测都很重要，对诊断新生儿先天性肾上腺增生和类固醇合成缺陷尤为重要。许多实验室对雄激素的测定往往仅限于睾酮。为了更准确地评价两性雄激素的状况，测量其他雄激素，如雄烯二酮(ASD)、脱氢表雄酮(DHEA)和硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)，可以更全面的了解女性体内最丰富的循环雄激素的信息。
[0003]ASD和DHEA由肾上腺和性腺产生，是体内合成雌激素和睾酮激素的重要前体。DHEAS在女性几乎全部来自肾上腺，在男性则有一些来自于睾丸，是最丰富的循环雄激素。ASD、DHEA和DHEAS的分泌随年龄变化，从青少年开始分泌，在20430岁达到顶峰，然后逐渐下降。因为这三种化合物有一半以上的产量来自自肾上腺，是指示肾上腺雄性激素产量的良好标志物。ASD、DHEA和DHEAS常一起作为女性高雄激素的初筛项目，高雄激素血症是多囊卵巢综合征女性(PCOS)的一个常见特征，同时存在少排卵和/或微多囊卵巢形态，则可确诊为PCOS。因此，将患者定义为高雄激素血症具有重要的临床意义。不幸的是，临床上和生理性高雄激素症的评估通常依赖于不准确的方法。
[0004]常规的雄激素检测方法为自动化学发光免疫法，对于低浓度的样品存在很大的高估，可能会对许多多囊卵巢综合征女性的表型进行错误的分类，在个体代谢风险的估计方面存在错误。大多数常规实验室用于评估这些激素的方法的敏感性和准确性都很差，尤其是在女性参考范围。该领域主要科学团体推荐的液相或气相色谱
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质谱法和平衡透析法，通常只在研究实验室和一些临床实验室可用。如中国专利申请公布号CN114088859A，专利技术名称为“一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法”，公开了的方法提出了一种分离多组同分异构体并检测29种类固醇激素的方法，通过对超高效液相色谱的流动相和洗脱条件进行优化，使多组同分异构体得以分离，通过优化液相条件和质谱参数可以同时检测含量跨度在ng级至pg级的不同类固醇激素，实现了对样品中包含多组同分异构体在内的29种类固醇激素含量的同步检测，但依然存在检测限达不到检测游离ASD、DHEA和DHEAS的要求。此外，目前没有高质量的游离态化合物检测方法时，依赖于总化合物和性激素结合球蛋白测量，或游离雄激素指数或质量方程计算生物利用度分数计算游离态化合物的方法是不充分的。

技术实现思路

[0005]1、要解决的问题
[0006]针对现有高效液相色谱串联质谱技术检测血清中的ASD、DHEA和DHEAS时，采用免疫测定法只能对单个物质进行测定，对于多组分的测定需要大量的样品量和时间，且同时
对多组分雄激素进行测定，缺乏高质量游离态激素的测定手段，对由游离态激素的测定大多使用间接测试，基本手段为测量总激素以及蛋白总量，然后利用质量方程对游离态激素进行理论估算，其准确度不足，操作麻烦的技术问题，本申请提供一种同时测的血清中三种游离雄激素含量的方法，具有检出限低、准确度高、重现性好、耗时短的优点。本申请还提供了一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，仅需300μL血清样品即可实现检测，操作快速简便。
[0007]2、技术方案
[0008]为达到上述目的，提供的技术方案为：
[0009]本专利技术的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，所述雄激素为雄烯二酮、脱氢表雄酮和硫酸脱氢表雄酮，包括以下步骤：
[0010]包括先后使用超滤和液液萃取从血清样品中分离所述三种游离雄激素的步骤；
[0011]包括使用高效液相色谱串联质谱检测所述三种游离雄激素的步骤。
[0012]进一步的，所述超滤包括以下步骤：
[0013]在血清样品中加入缓冲液，静置，于4440℃，2000g离心1h。
[0014]优选的，600μL缓冲液加入300μL样品，静置5min，于25℃，2000g离心1h，最优的，于37℃，2000g离心1h。
[0015]优选的，所述缓冲液为4
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羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液；pH为7.4。
[0016]进一步的，所述液液萃取包括以下步骤：
[0017]超滤后得超滤液，在所述超滤液中加入内标溶液和萃取剂，涡旋3min，于4℃，12000g离心5min。
[0018]所述萃取剂为乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正己烷、二氯甲烷中的一种或几种；500μL超滤液加入30μL内标溶液和50041000μL萃取溶液。
[0019]优选的，萃取后，取上层液体，氮吹干后加入100μL的04100％甲醇溶液复溶，涡旋1min，取90μL加入96孔板，待上机检测。
[0020]进一步的，校准曲线溶液中，ASD的浓度为0.02410ng/mL；DHEA的浓度为14500ng/mL；DHEAS的浓度为1045000ng/mL；
[0021]质控品溶液中，ASD的浓度为0.145ng/mL，DHEA的浓度为54250ng/mL，DHEAS的浓度为5042500ng/mL；
[0022]ASD、DHEA和DHEAS的内标溶液分别为ASD
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d7、DHEA
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d6和DHEAS
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d6，溶于替代基质中，浓度分别为1ng/mL、50ng/mL和500ng/mL。
[0023]优选的，采用替代基质配制校准曲线和质控样品，所述替代基质为水、甲醇、乙腈中的一种或几种。
[0024]进一步的，所述校准曲线溶液中，ASD、DHEA和DHEAS的浓度梯度如下所示：
[0025][0026]所述质控品溶液中，ASD的浓度梯度为0.1、1、5ng/mL；DHEA的浓度梯度为5、50、250ng/mL；DHEAS的浓度梯度为50、500、2500ng/mL。
[0027]进一步的，所述高效液相色谱条件为：进样器温度：8℃；柱温：40℃；洗脱梯度如
下：
[0028][0029]所述流动相A：含氟化铵水溶液；
[0030]所述流动相B：含甲醇溶液。
[0031]优选的，使用ACQUITYBEH C18(2.1
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50mm 1.7μm)(Waters)色谱柱；所述流动相A为045mM氟化铵水溶液。
[0032]进一步的，所述质谱条件为：多反应监测参数如下：
[0033][0034]扫描模式：多反应离子监测；电离模式：正、负离子模式；正离子毛细管电压：3.0kV，负离子毛细管电压：
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2.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：550℃；脱溶剂气流速：800L/Hr。
[0035]一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的试剂盒，所述雄激素为雄烯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，所述雄激素为雄烯二酮、脱氢表雄酮和硫酸脱氢表雄酮，其特征在于：包括以下步骤：包括先后使用超滤和液液萃取从血清样品中分离所述三种游离雄激素的步骤；包括使用高效液相色谱串联质谱检测所述三种游离雄激素的步骤。2.根据权利要求1所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，其特征在于：所述超滤包括以下步骤：在血清样品中加入缓冲液，静置，于4440℃，2000g离心1h。3.根据权利要求1所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，其特征在于：所述液液萃取包括以下步骤：超滤后得超滤液，在所述超滤液中加入内标溶液和萃取剂，涡旋3min，于4℃，12000g离心5min。4.根据权利要求1
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3任一项所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，其特征在于：校准曲线溶液中，ASD的浓度为0.02410ng/mL；DHEA的浓度为14500ng/mL；DHEAS的浓度为1045000ng/mL；质控品溶液中，ASD的浓度为0.145ng/mL，DHEA的浓度为54250ng/mL，DHEAS的浓度为5042500ng/mL；ASD、DHEA和DHEAS的内标溶液分别为ASD
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d7、DHEA
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d6和DHEAS
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d6，溶于替代基质中，浓度分别为1ng/mL、50ng/mL和500ng/mL。5.根据权利要求4所述的一种同时测定血清中三种游离雄激素含量的方法，其特征在于：所述校准曲线溶液中，ASD、DHEA和DHEAS的浓度梯度如下所示：所述质控品溶液中，ASD的浓度梯度为0.1、1、5ng/mL；DHEA的浓度梯度为5、50、250ng/mL；DHEAS的浓度梯度为50、500、2500ng/mL。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭军，江振作，刘洋，谢沙莎，
申请(专利权)人：合肥歆智医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：