直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法及检测试剂盒，采用超高效液相色谱

【技术实现步骤摘要】
直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术属于尿液定量检测
，具体涉及一种快速直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法及用于尿液中羟氯喹及其三种代谢产物检测的试剂盒。

技术介绍

[0002]羟氯喹(Hydroxychloroquine，HCQ)自上世纪50年代开始替代氯喹(Chloroquine，CQ)在临床上广泛应用于疟疾的治疗[胡晶莹，沈利，潘卫庆.恶性疟原虫氯喹抗性机制研究进展[J].中国热带医学，2009，09(12)：2315
‑
231.]。近年来多项研究发现HCQ具有调节免疫系统、抗炎、调节细胞因子释放等作用，因此目前多用于类风湿、系统性红斑狼疮、慢性关节炎等免疫系统疾病的治疗。此外，HCQ还可通过抑制肿瘤内的自噬作用从而发挥抗肿瘤作用，同时可增强多种抗肿瘤药物的疗效[Liu LQ,Wang SB,Shao YF,Shi JN,et al.Hydroxychloroquine potentiates the anti
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cancer effect of bevacizumab on glioblastoma via the inhibition of autophagy[J].Biomed Pharmacother.2019,118:109339./Zhang Y,Luo P,Leng P.Effect of Autophagy Inhibitor Hydroxychloroquine on Chemosensitivity of Castration
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resistant Prostate Cancer[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban.2019 May；50(3):323
‑
327.]。HCQ是目前临床上一种成熟有效的治疗疟疾及风湿免疫类疾病的药物，临床应用时间长。
[0003]HCQ是CQ的羟基取代产物，具亲脂性和弱碱性，分子式为C
18
H
26
ClN3O，分子量335.87(式1)。HCQ大约有50％经过肝脏代谢，42％经肾脏代谢，约25
‑
50％的HCQ以原型从肾脏排出体外[王才惠,段西凌.羟氯喹在治疗皮肤病中的应用[J].临床皮肤科杂志,2013,42(4):259
‑
261.]。因此，通过对尿液中HCQ及其代谢产物的检测有助于我们深入了解羟氯喹的排泄规律，监测体内排泄量。
[0004][0005]HCQ在肝脏通过CYP2D6、CYP2C8、CYP3A4、CYP3A5代谢为三个主要的代谢产物：脱乙基氯喹(DCQ)、双脱乙基氯喹(BDCQ)、单脱乙基羟氯喹(DHCQ)；DHCQ治疗类风湿关节炎的作用可能优于HCQ本身，而BDCQ和HCQ本身同胃肠道不良反应具有一定的相关性[Munster T,Gibbs JP,Shen D,Baethge BA,Botstein GR,Caldwell J,Dietz F,Ettlinger R,Golden HE,Lindsley H.Hydroxychloroquine concentration
–
response relationships inpatients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis&Rheumatology.2002；46:1460
–
1469.]。
[0006]Li等报道了在中国健康男性人群中(n＝20)，单次口服HCQ 200mg，血浆t
1/2
约为298
±
105h(mean
±
SD，下同)，ACU0‑
∞
为1950
±
435ng.h/ml，C
max
为44.1
±
27.6ng/mL，t
max
为3.85
±
1.04h[Hong
‑
wei Fan,Zhi
‑
xiang Ma,Jing Chen,Xing
‑
ye Yang，et al.Pharmacokinetics and Bioequivalence Study of Hydroxychloroquine Sulfate Tablets in Chinese Healthy Volunteers by LC
–
MS/MS[J].Rheumatol Ther.2015 Dec；2(2):183
–
195.]。
[0007]BROWN等报道了白人单次口服200mg HCQ后为非线性药物代谢，生物利用度为70
‑
80％，血浆终末半衰期t
1/2
为50
±
16天(mean
±
range)，全血t
1/2
为44
±
12天(mean
±
range)，血浆C
max
为46ng/mL(range：34
‑
79ng/mL)，全血C
max
为244ng/mL(range：188
‑
427ng/mL)，t
max
为3.2h(range：2
‑
4.5h)。HCQ在体内有广泛而快速的组织分布和极慢速末端消除特征，特别容易蓄积在脾、肝、肾、心、眼等脏器，血液清除率仅为96mL/min，其多剂量给药需3
‑
6个月才能达到稳态[Furst DE.Pharmacokinetics of hydroxychloroquine and chloroquine during treatment of rheumatic diseases[J].Lupus.1996；5((Suppl 1)):S11
–
5.]。
[0008]代谢产物的尿液排泄量通常能反映该产物的体内暴露量。目前，已有研究报道了通过LC
‑
MS/MS定量小鼠全血和组织样本中的HCQ及其代谢产物[Chhonker YS,Sleightholm RL,Li J, D,Murry DJ.Simultaneous quantitation of hydroxychloroquine and its metabolites in mouse blood and tissues using LC
‑
ESI
‑
MS/MS:An application for pharmacokinetic studies.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2018 Jan 1；1072:320
‑
327.]。但现阶段尚未发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，对羟氯喹及其代谢产物脱乙基氯喹(DCQ)、双脱乙基氯喹(BDCQ)、单脱乙基羟氯喹(DHCQ)进行检测，其特征在于，采用超高效液相色谱
‑
串联质谱进行检测，包括以下步骤：A)对待检尿液样本进行预处理：取一定量尿液样本于1.5mL离心管中，加入20倍体积的初始比例流动相，涡旋后按照体积比20:1将尿液样本和提取液混合，并进行正压过滤；B)采用超高效液相色谱将预处理后待检尿液样本中的羟氯喹及其代谢产物同尿液中的其它成分进行分离；C)采用串联质谱检测羟氯喹及其代谢产物的含量，羟氯喹的同位素为内标，以标准曲线法计算尿液中羟氯喹及其代谢产物的含量，其中，步骤B)中的色谱条件为：色谱柱为ZORBAX SB
‑
C8柱；流速为0.25mL/min，柱温为40℃，进样量为5μL；流动相A为0.2％FA
‑
10mmol醋酸铵水溶液，流动相B为质谱级甲醇，采用梯度洗脱方式进行分离；流动相洗脱参数如下：0～1min，流动相A为95％，流动相B为5％，1.1～4min，流动相A为5％，流动相B为95％；步骤C)中的质谱条件为：在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为4500V；干燥气温度为320℃；干燥气流速为10L/min；鞘气温度为400℃；鞘气流速为12L/min；喷雾器压力45psi；碰撞气压力为0.2MPa，监测目标化合物羟氯喹离子对为m/z 336.1
→
247，出口电压110FV，碰撞能量18，单脱乙基羟氯喹离子对为m/z 308.2
→
130.1，出口电压70FV，碰撞能量17；脱乙基氯喹的离子对为m/z 292.1
→
179，出口电压85FV，碰撞能量23；双脱乙基氯喹的离子对为m/z264.1
→
179，出口电压120FV，碰撞能量24。2.根据权利要求1所述的直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，其特征在于：其中，步骤A)中，所述提取液为含100ng/mL内标羟氯喹
‑
d4的甲醇溶液。3.根据权利要求1所述的直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，其特征在于：其中，步骤(C)中，内标化合物HCQ
‑
d4离子对为m/z 340.1
→
247.1，出口电压90FV，碰撞能量20。4.根据权利要求1所述的直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，其特征在于：其中，步骤C)中，校正曲线包含有S1～S12十二个浓度点，所述校正曲线的建立方法如下：所述标准曲线的建立方法为：精密吸取HCQ、DHCQ、DCQ、BDCQ工作溶液适量，分别置于1.5mL离心管中混合，使...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔莉莉，王志鹏，高守红，邱实，陶霞，陈万生，
申请(专利权)人：上海长征医院，
类型：发明
国别省市：