一种枯草芽孢杆菌突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。所述枯草芽孢杆菌突变菌株是通过紫外诱变方法筛选获得的，已于2020年11月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020698，可广泛应用于海藻酸裂解酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，应用前景广阔。应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程与微生物改造
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。

技术介绍

[0002]生物能源作为未来可能替代石油的新能源，具有可再生、低污染等特点，具有广阔的研究前景。生物能源按所用原料可分为三类，第一类生物能源是以粮食作物和产糖作物为原料，被称为第一代生物能源。虽然其生产技术相当成熟，但因原料价格昂贵、与粮争地的问题，与人类的生存和发展产生了矛盾，因此其开发受到了限制。第二类是以木质纤维素为原料发酵生产乙醇等能源，称为第二代生物燃料技术。但是，木质纤维素为原料的生物能源在预处理、酶水解和转化率等技术方面遇到了瓶颈，至今未能实现大规模商业化生产。海藻酸等海藻生物质作为第三代生物能源的原料，被视为解决能源危机的潜在途径。美国能源部己进行了多年的研究，取得了很大进展，日本、德国、印度等国也都进行了研发。相关研究人员认为，利用藻类及其提取物如海藻酸生产生物燃料具有广阔的发展前景。藻类生物燃料很可能成为未来最重要的可再生能源之一。
[0003]目前，海藻酸降解的方法可分为三大类：一类是化学降解法，前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。此外，还有过氧化氢氧化降解法；第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸；第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，环境友好，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一或组合使用不同底物专一性的酶制剂。酶降解海藻酸的反应过程中还可以提供序列和构型等方面的信息，因而更适合于海藻酸的降解和海藻酸寡糖的制备，所以，以酶解法为代表的生物降解必然会逐步取代传统的化学降解，在未来的商业生产中占到优势地位。
[0004]海藻酸裂解酶的来源广泛，主要有三大类，第一类是微生物，如海洋细菌、土壤细菌、真菌等，第二类是海洋软体动物和棘皮动物，如海螺、海参、鲍鱼等、第三类是植物，如巨藻、泡叶藻、海带等。目前，海藻酸裂解酶的生产大多是依靠海藻酸分解菌。例如，沈宏等发现了一株高产海藻酸裂解酶的微泡菌Microbulbifer sp.SH
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1，该菌可用于发酵生产海藻酸裂解酶，也可直接降解褐藻。张绪等从自制海藻堆肥中分离得到鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. ZHO，并从该菌克隆出4种海藻酸裂解酶基因用于海藻酸的完全降解。Li等纯化并研究了Pseudoalteromonassp. SM0524 的海藻酸裂解酶 Aly
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SJ02，其酶活高达65.4 U/mg。高洁等从腐烂海带中分离得到解藻酸弧菌BH17，酶活达到83 U/mL，优于目前已报道的多数菌株酶活。
[0005]海藻酸分解菌作为海藻酸裂解酶生产者的角色被研究和应用，随着近年来能源危机的加剧，海藻酸分解菌在利用海藻酸等海藻生物质生产生物能源也扮演了重要角色。进一步挖掘高产海藻酸裂解酶的生产菌株对于生态环境和经济的可持续发展以及有效利用
海洋资源都有着重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。申请人通过紫外诱变的方法筛选获得的突变菌株，能大幅提高海藻酸裂解酶的表达量，降低该酶的生产成本，从而有利于促进该酶的广泛应用。
[0007]本专利技术一方面提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌，其携带有表达海藻酸裂解酶的重组质粒。
[0008]所述海藻酸裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
[0009]本专利技术一方面提供了一种枯草芽孢杆菌突变菌，是以上述枯草芽孢杆菌工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法获得的。
[0010]所述枯草芽孢杆菌突变菌命名为枯草芽孢杆菌AH
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29（Bacillus subtilis AH
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29），已于2020年11月6日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2020698。
[0011]本专利技术还提供了一种生产海藻酸裂解酶的方法，是以上述枯草芽孢杆菌突变菌为发酵菌株。
[0012]本专利技术首先构建得到高效重组表达海藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌BS ALH308，然后以该菌株为出发菌株，通过紫外诱变方法筛选获得突变菌株枯草芽孢杆菌AH
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29。所述突变菌株摇瓶发酵酶活高达350 U/ml，20 L罐发酵酶活高达3888 U/ml，比出发菌分别提高的52.3%和42.6%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌产的海藻酸裂解酶最适作用温度为50℃，最适作用pH为8.5，与出发菌株一致。本专利技术提供的突变菌株枯草芽孢杆菌AH
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29可广泛应用于海藻酸裂解酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进海藻酸裂解酶的推广与应用。
[0013]说明书附图图1为枯草芽孢杆菌AH
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29产海藻酸裂解酶作用pH
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相对酶活曲线；图2为枯草芽孢杆菌AH
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29产海藻酸裂解酶作用温度
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相对酶活曲线。
具体实施方式
[0014]下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，实现本专利技术的方法不应限于本专利技术实施例所记载的具体方法步骤。
[0015]本专利技术实施例中所述培养基中各组分及其含量分别为：LB平板：胰蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，NaCl 1%，琼脂 1.5%；LB液体培养基：胰蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，NaCl 1%；1*最低盐溶液：K2HPO
4 14 g/L，KH2PO
4 6 g/L，（NH4）2SO
4 2 g/L，柠檬酸三钠 1 g/L， MgSO4•
7H2O 0.2 g/L；
GMI溶液：1*最低盐溶液 95.6 ml，20%葡萄糖 2.5 ml，5%水解酪蛋白 0.4 ml，10% 酵母粉汁 1 ml；GMII溶液：1*最低盐溶液96.98 ml，20%葡萄糖2.5 ml，5%水解酪蛋白0.08 ml，10%酵母粉汁0.04 ml，1 M MgCl
2 0.25 ml，1 M CaCl
2 0.05 ml；牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%，pH 7.2。
[0016]下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述。
[0017]实施例1 枯草芽孢杆菌表达载体的构建1.1基因克隆根据NCBI的公开报道，人工合成海藻酸裂解酶基因，并根据枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的密本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌工程菌株携带有表达海藻酸裂解酶的重组质粒。2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述的海藻酸裂解酶基因序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。3.一种枯草芽孢杆菌突变菌株，其特征在于，所述的突变菌株是以权利要求2所述的工程菌株为出发菌，通过紫外诱变方...

【专利技术属性】
技术研发人员：石增秀，齐建，张霞，张金祥，李玉强，王华明，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：