利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株及其构建方法与应用，本发明专利技术通过融合PCR的方式构建启动子Ppr和乳铁蛋白的表达框，并利用P43启动子控制阻遏蛋白CI857的表达。进一步优化Ppr启动子上CI857结合位点的序列的间隔长度，通过发酵实验发现，不同长度的间隔序列导致不同的转录水平。其中三个结合位点之间的间隔序列分别为10bp时，与初始启动子相比，乳铁蛋白的转录水平提高了将近5倍，通过western blot发现乳铁蛋白的表达量增加了约3.2倍，达到了80mg/L。本发明专利技术能够有效的提高乳铁蛋白的表达量，并避免额外诱导剂的添加。并避免额外诱导剂的添加。并避免额外诱导剂的添加。

【技术实现步骤摘要】
ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0011]进一步地，三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的间隔序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0012]进一步地，所述的人乳铁蛋白和Ppr启动子整合在质粒peT20b上。
[0013]进一步地，所述的宿主为大肠杆菌BL21。
[0014]本专利技术的第二个目的是提供所述的菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0015]S1、将人乳铁蛋白编码基因和Ppr启动子序列整合至质粒peT20b上；
[0016]S2、在Ppr启动子上三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间分别插入间隔序列，获得重组质粒；
[0017]S3、将重组质粒转化至大肠杆菌宿主中，获得所述的菌株。
[0018]本专利技术的第三个目的是提供所述的菌株在发酵生产乳铁蛋白中的应用。
[0019]本专利技术的有益效果是：
[0020]本专利技术通过融合PCR的方式构建启动子Ppr和乳铁蛋白的表达框，并利用P43启动子控制阻遏蛋白CI857的表达。进一步优化Ppr启动子上CI857结合位点的序列的间隔长度，通过发酵实验发现，不同长度的间隔序列导致不同的转录水平。其中三个结合位点之间的间隔序列均为10bp时，与初始启动子相比，乳铁蛋白的转录水平提高了将近5倍，通过western blot发现乳铁蛋白的表达量增加了约3.2倍，达到了80mg/L。本专利技术能够有效的提高乳铁蛋白的表达量，并避免额外诱导剂的添加。
附图说明：
[0021]图1为不同间隔序列对启动子活性的影响。
[0022]图2为乳铁蛋白的表达量。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0024]本专利技术以大肠杆菌BL21为出发菌株，利用温敏型启动子Ppr表达乳铁蛋白，实现提高乳铁蛋白的表达量，以及无需添加诱导剂的目的，提供了一种增加蛋白表达水平的方法。
[0025]本专利技术首先提供一种利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株，所述的菌株以大肠杆菌为宿主异源表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的人乳铁蛋白，其中，人乳铁蛋白通过Ppr启动子启动表达，Ppr启动子包括三个阻遏蛋白CI857的结合位点，阻遏蛋白CI857通过P43启动子控制表达。
[0026]本专利技术还通过调节三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的间隔序列长度，来调控人乳铁蛋白的转录水平，发现间隔序列长度为10bp时，乳铁蛋白的转录水平提高了将近5倍。本专利技术三个阻遏蛋白CI857的结合位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的长度为10bp的间隔序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0027]在具体实施例中，本专利技术的人乳铁蛋白和Ppr启动子通过整合在质粒peT20b上，转化至大肠杆菌BL21宿主中进行表达。
[0028]实施例1：通过融合PCR构建温敏型启动子表达乳铁蛋白的开放阅读框
[0029]人源乳铁蛋白(HLF)的序列经过密码优化之后，由金唯智合成序列1(如SEQ ID NO.1所示)，并通过引物1和引物2扩增如表1。随后通过Gibson组装的方式将乳铁蛋白基因整合在peT20b质粒上，获得重组质粒peT20b
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hlf。
[0030]表1扩增乳铁蛋白的引物
[0031]引物1(SEQ ID NO.14)tcgctgcccagccggcgatggccATGAAATTGGTTTTTTTGGTTTTGTTGT引物2(SEQ ID NO.15)gtgctcgagtgcggcTTTTCTCAAAAATTCACAAGCTTCCAACAATG引物3(SEQ ID NO.16)gcgtatcggtgattcattctgctaac引物4(SEQ ID NO.17)AGCGACATCACCAGCACCAT
[0032]将上述反应液转化JM109感受态，过液培养获得的工程菌。利用引物3和引物4通过菌落PCR的方式验证重组质粒是否构建成功。
[0033]实施例2：通过融合PCR构建受温度调控的基因回路
[0034]阻遏蛋白CI857的基因序列通过金唯智公司合成序列2(如SEQ ID NO.2所示)，并通过引物5和6扩增如表2。并利用引物7和引物8扩增获得启动子Ppr序列3(如SEQ ID NO.3所示)，随后通过Gibson组装的方式将阻遏蛋白、启动子Ppr整合在实施例1中构建的peT20b
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hlf质粒上，获得重组质粒peT20b
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hlf
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Ppr，构建温度调控基因回路。
[0035]表2扩增阻遏蛋白和启动子的引物
[0036]引物5(SEQ ID NO.18)cccaacgctgcccgagatctttagccaaatgtttcttccggcca引物6(SEQ ID NO.19)cttgcggtgatagatttaacgttgataggtggtatgttttcgcttga引物7(SEQ ID NO.20)caagcgaaaacataccacctatcaacgttaaatctatcaccgcaaggga引物8(SEQ ID NO.21)gcggtcggcagcaggtatttcatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaatt
[0037]启动子Ppr上存在三个阻遏蛋白CI857的结合位点，名称分别为“Or3”、“Os2”、“Or1”。结合位点的序列分别为“CTATCACCGCAAGGGATA”(如SEQ ID NO.4所示)、“TAACACCGTGCGTGTTG”(如SEQ ID NO.5所示)和“TACCTCTGGCGGTGATAA”(如SEQ ID NO.6所示)。为了改变三个结合位点之间的间隔，同样利用Gibson组装的方式将不同长度的随机序列插入到三个结合位点之间(序列长度包括5bp、8bp、10bp、12bp、15bp和20bp)，间隔序列的碱基分别是“ATATC”(如SEQ ID NO.7所示)、“ACTATTTC”(如SEQ ID NO.8所示)、“CACTATTTCT”(如SEQ ID NO.9所示)、“GGTTGCATGTAC”(如SEQ ID NO.10所示)、“TGGTTGCATGTACGC”(如SEQ ID NO.11所示)、“ATTGGTTGCATGTACGCTCG”(如SEQ ID NO.12所示)。然后把重组质粒通过化学转化的方式转化进大肠杆菌中，然后通过发酵检测绿色荧光蛋白荧光的变化(图1)。结果显示，当间隔序列超过12bp时荧光水平随着间隔序列的增加而减弱。当间隔序列为10bp时，与初始启动子相比，荧光水平增加了将近5倍，最终确定Ppr启动子上最终的调控序列为始启动子相比，荧光水平增加了将近5倍，最终确定Ppr启本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用温敏型启动子高效表达乳铁蛋白的菌株，其特征在于，所述的菌株以大肠杆菌为宿主异源表达人乳铁蛋白，其中，所述的人乳铁蛋白通过Ppr启动子启动表达。2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述的Ppr启动子包括三个阻遏蛋白CI857的结合位点，所述的阻遏蛋白CI857通过P43启动子控制表达。3.根据权利要求2所述的菌株，其特征在于，三个阻遏蛋白CI857的结合位点之间的间隔序列长度为10bp。4.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述的人乳铁蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。5.根据权利要求3所述的菌株，其特征在于，三个阻遏蛋白CI857的结合位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪芹，刘龙，陈坚，堵国成，李江华，刘延峰，崔世修，
申请(专利权)人：白马未来食品研究院，
类型：发明
国别省市：