一种增强1-磷酸果糖激酶基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种提升谷氨酰胺转氨酶产量的方法，通过增强1

【技术实现步骤摘要】
一种增强1
‑
磷酸果糖激酶基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种增强1
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磷酸果糖激酶(1
‑
phosphofructokinase) 基因SMDS_3792转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法。

技术介绍

[0002]谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，EC 2.3.2.13，TGase)又称转谷氨酰胺酶，是由茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的。TGase主要催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ
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羟胺基团与伯胺化合物(酰基受体)之间发生酰基转移反应，使蛋白质发生共价交联，通过胺的导入、交联及脱胺三种途径改变蛋白质的功能性质。TGase介导的分子交联能够改善蛋白质的热稳定性、持水力等特性，有助于形成强有力的凝胶，改善蛋白质的品质。TGase是一种外分泌蛋白，在胞内以pre
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pro
‑
TGase的形式存在，通过跨膜运输，识别信号肽，并以pro
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TGase的前体蛋白的形式转运到胞外。在胞外pro
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TGase经过内切金属蛋白酶TAMEP从N端切割一段多肽序列，得到FRAP
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TGase，此时的酶已经具有一定的催化能力，可以催化蛋白质交联成多聚物；再经过丝氨酸蛋白酶TAP的切割，切掉N端四肽Phe
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Arg
‑
Ala
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Pro(即FRAP)，形成最终成熟的TGase。该酶分子量为37.9kD，由331 个氨基酸组成。
[0003]由于TGase具有非常特殊的结构及强交联能力，目前作为一种新型的食品添加剂，在世界范围的食品工业中广泛应用。包括在肉制品中可以改善经机械处理的肉制品的质地和结构，通过交联作用增强凝胶性，减轻断裂程度，从而提升产品品质并提高持水力；在乳制品中，提高酸奶质量，改善乳蛋白的乳化特性及提高乳蛋白的热稳定性等；在食品包装及膜领域被广泛用于改善生物聚合物的薄膜的机械和阻隔性能，如明胶、蛋清蛋白、乳清蛋白及其与果胶、壳聚糖的组合等等。同时，在面制品、烘焙食品以及大豆蛋白产品等加工过程中，同样有很大的应用前景。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供高产谷氨酰胺转氨酶TGase的菌株 TGS104，以及一种通过增强1
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磷酸果糖激酶(1
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phosphofructokinase)基因SMDS_3792的转录水平以提高TGase发酵水平的方法。本专利技术基于基因组学信息，通过在茂原链霉菌C2中利用人工强启动子kasOp*过量表达内源1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792，最终提升谷氨酰胺转氨酶产量。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种茂原链霉菌C2，由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis C2，保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020194，保藏日期为2020年6月10日。
[0007]本专利技术还提供了一种高产谷氨酰胺转氨酶TGase的菌株TGS104，所述菌株通过增
强 1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平获得。
[0008]进一步的，所述菌株由茂原链霉菌C2过量表达来源于茂原链霉菌C2的 1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792后获得。
[0009]进一步的，所述菌株通过在茂原链霉菌C2中利用人工强启动子kasOp*过量表达 1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792后获得。
[0010]所述菌株的1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达。
[0011]“过量表达”指在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的1
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phosphofructokinase 基因SMDS_3792(来源于茂原链霉菌C2)，增强1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平。
[0012]所述菌株含有人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的 1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的表达盒。
[0013]所述表达盒含有：人工强启动子kasOp*、1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792、转录终止序列。
[0014]所述1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]本专利技术还提供了一种表达盒，所述表达盒含有：人工强启动子kasOp*、 1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792、转录终止序列。
[0016]本专利技术还提供了所述的表达盒在高效筛选菌株TGS104中的应用。
[0017]本专利技术还提供了一种通过增强1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平以提高 TGase发酵水平的方法，所述方法的具体步骤如下：
[0018]第一步：设计并构建用于过量表达内源1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的整合型质粒载体pTDS104；
[0019]第二步：利用整合型质粒载体pTDS104(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp* 启动子)，在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的1
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phosphofructokinase基因 SMDS_3792，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS104。
[0020]第三步：将培养的1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达突变株TGS104的孢子接种于种子培养基中，25
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35℃、180
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220rpm(优选地，30℃、200rpm)的条件下培养20
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24 h(优选地，24h)，以8
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15％(优选地，10％)的接种量转接至发酵培养基中，25
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35℃、180
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220 rpm(优选地，30℃、200rpm)的条件下发酵28
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32h(优选地，28h)，收本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种茂原链霉菌C2，其特征在于，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis C2，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2020194，保藏日期为2020年6月10日。2.一种谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104，其特征在于，所述菌株通过增强1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平获得。3.如权利要求2所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104，其特征在于，所述菌株通过在如权利要求1所述的茂原链霉菌C2中利用人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792后获得。4.如权利要求2或3所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104，其特征在于，所述菌株的1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达；和/或，所述菌株含有人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的表达盒；和/或，所述1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的序列如SEQ ID NO.1所示。5.如权利要求4所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104，其特征在于，所述表达盒含有人工强启动子kasOp*、1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792、转录终止序列。6.一种增强1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法，其特征在于，通过在茂原链霉菌C2中利用人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792，进而提升谷氨酰胺转氨酶产量；所述方法的具体步骤如下：第一步：设计并构建用于过量表达1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792的整合型质粒载体pTDS104；第二步：利用整合型质粒载体pTDS104，在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的来源于如权利要求1所述的茂原链霉菌C2的1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS104；第三步：将培养的1
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phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达突变株TGS104的孢子接种于种子培养基中，25
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35℃、180
‑
220rpm的条件下培养20
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24h，以8
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15％的接种量转接至发酵培养基中，25
‑
35℃、180
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220rpm的条件下发酵28
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32h，收集发酵液并进行酶活检测。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述整合型质粒载体pTDS104...

【专利技术属性】
技术研发人员：步国建，武立清，白林泉，
申请(专利权)人：江苏东汇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：