一种增强vgbS基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种提升谷氨酰胺转氨酶产量的方法，通过增强vgbS基因的转录水平，从分子水平上提高微生物发酵过程中的溶氧水平，促进谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌，进而提升谷氨酰胺转氨酶产量的方法。通过在茂原链霉菌IPIE中，利用TGase的启动子TGasep*过量表达vgbS基因，得到高产谷氨酰胺转氨酶的突变株TGS105。增强vgbS基因的转录水平可以有效提高微生物发酵过程中的溶氧水平、有利于谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。量。量。

【技术实现步骤摘要】
一种增强vgbS基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，涉及一种增强vgbS基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法。

技术介绍

[0002]谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，EC 2.3.2.13，TGase)是由茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)产生的是一类以异肽键[ε
‑
(γ
‑
谷氨酰基)
‑
赖氨酸]催化蛋白质或多肽链之间的酰基转移反应的转移酶，使Gln残基和Lys残基之间形成共价键，使得蛋白质或多肽发生交联，从而改变蛋白质的功能性质。TGase是一种外分泌蛋白，分子量为37.9kD，由331 个氨基酸组成，在胞内以pre
‑
pro
‑
TGase的形式存在，通过跨膜运输，识别信号肽，以 pro
‑
TGase的前体蛋白的形式转运到胞外。Pro
‑
TGase不具有催化活性，经过金属蛋白酶 TAMEP切割信号肽成为FRAP
‑
TGase，再经丝氨酸蛋白酶SM
‑
TAP切割成为最终成熟的 TGase。
[0003]基于TGase独特的蛋白交联功能，使其在很多领域中都发挥着重要的作用，在食品领域通过交联谷氨酰胺残基和赖氨酸残基能够将小块肉类结合成大块提高原料的来源及利用率；在生物
，TGase通过对蛋白质进行特异性修饰，从而用于生化检测；在医药领域，因TGase修饰的蛋白结合反应条件温和、操作简单、对药用蛋白原有的性质影响较小等优点，使其可以催化PEG对蛋白进行位点特异性位点修饰，同时，研究发现在 TGase的作用下，结合了抗体的细胞毒性药物比非靶向细胞毒性药物安全性高，并且具有更好的治疗效果。
[0004]微生物发酵是严格耗氧的过程，由于氧气在浓稠的发酵液中溶解度很低，所以溶氧成为提高产量的瓶颈性因素。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供高产谷氨酰胺转氨酶TGase 的菌株TGS105，以及一种通过增强vgbS基因的转录水平以提高TGase发酵水平的方法。本专利技术选择优化后的vgbS基因，通过在茂原链霉菌IPIE中利用TGase的启动子TGasep* 过量表达vgbS基因，可以有效提高微生物发酵过程中的溶氧水平，提升谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌效率，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种茂原链霉菌IPIE，由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis IPIE，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020197，保藏日期为2020年6月10日。
[0008]本专利技术还提供了一种高产谷氨酰胺转氨酶TGase的菌株TGS105，所述菌株通过增
强 vgbS基因的转录水平而获得的。
[0009]进一步地，该菌株由茂原链霉菌IPIE过量表达来源于透明颤菌中优化后的vgbS基因后获得。
[0010]进一步地，该菌株通过在茂原链霉菌IPIE中利用TGase的启动子TGasep*过量表达 vgbS基因后获得。
[0011]所述菌株的vgbS基因过量表达。
[0012]“过量表达”指在受体菌茂原链霉菌IPIE染色体上插入一个拷贝的vgbS基因(来源于透明颤菌)，增强vgbS基因的转录水平。
[0013]所述菌株含有启动子TGasep*过量表达来源于透明颤菌中优化后的vgbS基因的表达盒。
[0014]所述表达盒含有启动子TGasep*、vgbS基因、转录终止序列。
[0015]所述vgbS编码基因的序列如下SEQ ID NO.1所示。
[0016]本专利技术还提供了一种表达盒，所述表达盒含有启动子TGasep*、vgbS基因、转录终止序列。
[0017]本专利技术还提供了所述的表达盒在高效筛选菌株TGS105中的应用。
[0018]本专利技术还提供了一种通过增强vgbS基因的转录水平以提高TGase发酵水平的方法，包括以下步骤：
[0019]第一步：设计并构建用于过量表达vgbS基因的整合型质粒载体pTDS105；
[0020]第二步：利用整合型质粒载体pTDS105(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有TGasep* 启动子)，在受体菌茂原链霉菌IPIE染色体上插入一个拷贝的vgbS基因(来源于透明颤菌优化后的)，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS105；
[0021]第三步：将活化后的vgbS基因过量表达突变株TGS105的孢子接种于种子培养基中， 25
‑
35℃、180
‑
220rpm(优选地，30℃、200rpm)培养20
‑
24h(优选地，24h)，以8
‑
15％ (优选地，10％)的接种量转接至发酵培养基中，分别于25
‑
35℃、180rpm和25
‑
35℃、 150rpm(优选地，30℃、180rpm和30℃、150rpm)的条件下发酵28
‑
32h(优选地，28h)，收集发酵液并进行酶活检测。
[0022]步骤一中，所述载体pTDS105的构建方法是：通过PCR扩增得到1008bp的TGpr 和441bp的vgbS基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3
‑
Kp* 的BamHI/EcoRI位点。
[0023]步骤三中，所述种子培养基包括：甘油1
‑
3w/v％，酵母提取物0.5
‑
1w/v％，鱼粉蛋白胨2
‑
3w/v％，MgSO4·
7H2O 0.1
‑
0.5w/v％，K2HPO4·
3H2O 0.1
‑
0.5w/v％，pH 7.4；优选地，为甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO4·
7H2O 0.2w/v％， K2HPO4·
3H2O 0.2w/v％，pH 7.4。
[0024]步骤三中，所述发酵培养基包括：甘油1
‑
3w/v％，酵母提取物0.5
‑
1w/v％，鱼粉蛋白胨2
‑
3w/v％，MgSO4·
7H2O 0.1
‑
0.5w/v％，K2HPO4·
3H2O 0.1
‑
0.5w/v％，发酵促进剂0.1
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0.3 w/v％，pH 7.4；优选地，为甘油2w/v％，酵母提取物0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种茂原链霉菌IPIE，其特征在于，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis IPIE，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2020197，保藏日期为2020年6月10日。2.一种谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS105，其特征在于，所述菌株通过增强vgbS基因的转录水平而获得的。3.如权利要求2所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS105，其特征在于，所述菌株通过在如权利要求1所述的茂原链霉菌IPIE中利用TGase的启动子TGasep*过量表达来源于透明颤菌中优化后的vgbS基因后获得。4.如权利要求2或3所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS105，其特征在于，所述菌株的vgbS基因过量表达；和/或，所述vgbS编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述菌株含有启动子TGasep*过量表达来源于透明颤菌中优化后的vgbS基因的表达盒。5.如权利要求4所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS105，其特征在于，所述表达盒含有启动子TGasep*、vgbS基因、转录终止序列。6.一种增强vgbS基因的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法，其特征在于，通过在如权利要求1所述的茂原链霉菌IPIE中过量表达来源于透明颤菌中优化后的vgbS基因，提高微生物发酵过程中的溶氧水平，促进谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌，进而提升谷氨酰胺转氨酶产量；具体步骤如下：第一步：设计并构建用于过量表达vgbS基因的整合型质粒载体pTDS105；第二步：利用整合型质粒载体pTDS105，在受体菌茂原链霉菌IPIE染色体上插入一个拷贝的来源于透明颤菌优化后的vgbS基因，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS105；第三步：将活化后的vgbS基因过量表达突变株TGS105孢子接种于种子培养基中，25
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35℃、180
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220rpm的条件下培养20
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24h，以8
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15％的接种量转接至发酵培养基中，分别于25
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35℃、180rpm和25
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35℃、150rpm的条件下发酵28
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32h，收集发酵液并进行酶活检测。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述整合型质粒载体pTDS105的构建方法为：通过PCR扩增得到1008bp的TGpr和441bp的vgbS基因序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3
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Kp*的BamHI/Eco...

【专利技术属性】
技术研发人员：步国建，武立清，白林泉，
申请(专利权)人：江苏东汇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：