一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用，其制备方法包括以下步骤：将菌种活化，得到丁酸梭菌发酵液；离心，收集菌泥，然后加入保护剂溶液，混匀，再加入壁材溶液，混匀，最后冷冻干燥，得到丁酸梭菌制剂；其中，保护剂为脱脂乳、β

【技术实现步骤摘要】
一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及微生物制剂制备
，具体涉及一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]丁酸梭菌是一种革兰氏阳性、专性厌氧和内生孢子形成的细菌，对低pH和高温环境有很强的耐受性，对多种抗生素表现出耐药性，被认为是一种很好的饲料添加剂，此外，丁酸梭菌产生短链脂肪酸(SCFA)，特别是丁酸，为肠上皮的再生和修复以及肠道健康微生态环境的调节提供营养。丁酸梭菌细胞壁中富含多种抗原物质(肽聚糖和磷壁酸)，可诱导机体发生免疫反应，除了能够增强免疫反应外，饲料中添加丁酸梭菌还可提高动物的肠道抗氧化性能。丁酸梭菌作为益生菌，在肠道中的定植能力影响着作用的发挥，而定植能力的强弱除了与菌体本身有关外，还与制备工艺有关，冷冻干燥法是常用的菌剂制备方法之一，在真空冷冻干燥过程中，由于处于低温缺氧状态，菌体则会进入休眠状态，可以保持其原有特性，然而，在冷冻干燥过程中，细胞经历了不利的环境条件，对微生物产生损伤，主要表现为：细胞膜的损伤：干燥使得细胞膜通透性增加，对盐类敏感性增强；机械损伤：主要是结冰过程中冰晶对细胞膜的机械损伤；溶质损伤：在冰冻过程中细胞内水分溢出，细胞膜渗透压发生不可逆的改变。因此，需要在制备过程中加入冷冻保护剂，现有技术中单一保护剂已不能满足对微生物的保护。

技术实现思路

[0003]为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用，以解决现有技术中丁酸梭菌制剂定植效果差的问题。
[0004]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种丁酸梭菌制剂的制备方法，包括以下步骤：（1）将菌种活化，得到丁酸梭菌发酵液；（2）将丁酸梭菌发酵液离心，收集菌泥，然后加入保护剂溶液，混匀，再加入壁材溶液，混匀，最后冷冻干燥，得到丁酸梭菌制剂；其中，保护剂为脱脂乳、β
‑
环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的混合物，壁材为明胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠。
[0005]本专利技术的有益效果为：本专利技术通过保护剂和壁材的双重作用，能够有效的保证丁酸梭菌在凡纳滨对虾肠道中定植。
[0006]脱脂乳作为一种大分子物质，其中的乳清蛋白能够在菌体表面形成有效的保护层，并且为菌体提供多孔且轻的结构，增强复水性；β
‑
环状糊精是一种低聚糖，在冷冻干燥脱水的过程中起脱水保护剂的作用，能够防止在冷冻干燥升华过程中物理脱水对菌体的损害；葡萄糖中含有大量的自由羟基，在冷冻过程中。对细胞膜原有的水分子基团进行替代，进而与蛋白质和磷脂形成氢键，确保了细胞膜的完整性；磷酸氢二钾能够通过降低菌体中
的自由水含量，使得菌体代谢能力降低，从而达到防冻效果。此外，脱脂乳多孔且轻的结构能够作为载体，β
‑
环状糊精和磷酸氢二钾在附着的基础上，β
‑
环状糊精作用于菌体外，磷酸氢二钾作用于菌体内，葡萄糖保护菌体细胞膜，四种保护剂从内到外协同对菌体起到保护作用。
[0007]在冻干保护剂的基础上，分别选择明胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠为壁材。壁材主要起到乳化以及包被的作用，三种壁材均具有良好的成膜性能，并且都具有一定的乳化性，除了对含有保护剂的菌体二次包被外，壁材的成膜对菌剂应对环境的胁迫也起到良好的保护作用，尤其是应对动物消化道中胃酸和胆盐的胁迫。
[0008]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进：进一步，步骤（1）中丁酸梭菌发酵液中活菌数量≥1
×
108CFU/mL。
[0009]进一步，步骤（1）中活化的具体方法为：将冻干菌种接种于RCM液体培养基，于35
‑
37℃条件下，厌氧培养12
‑
16h，得到种子液，将种子液重复重复接种和厌氧培养操作2
‑
3次，然后将种子液接种于RCM液体培养基，于35
‑
37℃条件下，厌氧培养16
‑
24h，得到丁酸梭菌发酵液。
[0010]进一步，将种子液接种于RCM液体培养基时，接种量均为2
‑
5vt%。
[0011]进一步，步骤（2）中离心条件为：温度3
‑
5℃，转速3000
‑
5000r/min，时间10
‑
15min。
[0012]进一步，步骤（2）中保护剂溶液中脱脂乳、β
‑
环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的浓度分别为50
‑
150g/L，80
‑
120g/L，20
‑
100g/L和5
‑
15g/L，溶剂为生理盐水。
[0013]采用上述进一步技术方案的有益效果为：保护剂溶液浓度太低达不到保护菌体的作用，保护剂浓度过高同样地会降低菌体活性，在本专利技术采用了适宜的保护剂浓度，能够有效保护菌体的成活率。
[0014]进一步，步骤（2）中丁酸梭菌发酵液和保护剂溶液的体积比为8
‑
10：1。
[0015]采用上述进一步技术方案的有益效果为：丁酸梭菌发酵液和保护剂溶液的体积比为8
‑
10：1，能够更好的保护菌体，从而提高成活率。
[0016]进一步，步骤（2）中壁材溶液中明胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠的浓度均为10
‑
30g/L，溶剂为生理盐水。
[0017]采用上述进一步技术方案的有益效果为：壁材溶液是起着乳化包被作用，它的浓度对最终的效果产生影响，当浓度太大时，成膜及乳化效果差，不利于保护剂与菌体更好的结合，从而影响最终的成活率，本专利技术采用了适宜的浓度，能够有效保护菌体成活率。
[0018]进一步，步骤（2）中壁材溶液和保护剂溶液的体积比为0.5
‑
1：1。
[0019]采用上述进一步技术方案的有益效果为：壁材溶液和保护剂溶液的体积比为0.5
‑
1：1时，能够起到更好的包被作用，菌体成活率更高。
[0020]进一步，步骤（2）中保护剂溶液和壁材溶液在加入前均经过灭菌处理；其中，保护剂溶液的灭菌条件为：温度105
‑
110℃，灭菌10
‑
12min，壁材溶液的灭菌条件为：温度115
‑
121℃，灭菌15
‑
18min。
[0021]进一步，步骤（2）中冷冻干燥的条件为：
‑
80~
‑
75℃条件下，冷冻2
‑
3h，然后冷冻干燥48
‑
72h。
[0022]进一步，步骤（2）中混匀条件均为：在氮气氛围下，磁力搅拌。
[0023]本专利技术还提供一种丁酸梭菌制剂，该制剂是采用上述丁酸梭菌制剂的制备方法制
得。
[0024]本专利技术还提供上述丁酸梭菌制剂在制备益生菌菌剂、饲料或饲料添加剂方面的应用。
[0025]本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术通过保护本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将菌种活化，得到丁酸梭菌发酵液；（2）将丁酸梭菌发酵液离心，收集菌泥，然后加入保护剂溶液，混匀，再加入壁材溶液，混匀，最后冷冻干燥，得到丁酸梭菌制剂；其中，保护剂为脱脂乳、β
‑
环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的混合物，壁材为明胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠。2.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中丁酸梭菌发酵液中活菌数量≥1
×
108CFU/mL。3.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中活化的具体方法为：将冻干菌种接种于RCM液体培养基，于35
‑
37℃条件下，厌氧培养12
‑
16h，得到种子液，将种子液重复接种和厌氧培养操作2
‑
3次，然后将种子液接种于RCM液体培养基，于35
‑
37℃条件下，厌氧培养16
‑
24h，得到丁酸梭菌发酵液。4.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中离心条件为：温度3
‑
5℃，转速3000
‑
5000...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘泓宇，王琦，谭北平，范德朋，胡亚东，
申请(专利权)人：碧沃丰生物科技广东股份有限公司，
类型：发明
国别省市：