一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法及应用技术

本发明专利技术提出一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法，通过在茂原链霉菌IPIO中，利用谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达，获得诱变的出发菌种IPIO

【技术实现步骤摘要】
一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法及应用。

技术介绍

[0002]谷氨酰胺转氨酶(TGase)是由茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ
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酰胺基和赖氨酸的ε
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氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε
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(γ
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谷酰胺)
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赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质。TGase是外分泌蛋白，在胞内为pre
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pro
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MTGase初始形式，穿过细胞膜成为无活性的酶原pro
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TGase，经过金属蛋白酶TAMEP切割信号肽成为FRAP
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TGase，再经丝氨酸蛋白酶SM
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TAP切割成为最终成熟的 TGase。TGase作为一种蛋白交联剂，因其稳定性好、使用安全等优点而被广泛应用，在食品领域通过交联谷氨酰胺残基和赖氨酸残基能够将小块肉类结合成大块提高食品的美观度，通过整合氨基酸增加营养，生物合成TGase制作可降解塑料包装；在医药领域可用来交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物，催化明胶和胶原蛋白形成支架植入人体使器官再生等等。目前工业生产获得高产TGase的菌株多为诱变后进行筛选，但传统筛选费时、费力，获得高产TGase菌株的效率低下。<br/>
技术实现思路

[0003]本专利技术克服现有技术存在的问题，提出一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法，通过利用含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达的出发菌株，通过提高固体培养基中抗生素浓度进行筛选诱变后的菌株，从而获得谷氨酰胺转氨酶基因高表达的菌株，进而提升高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株筛选效率的方法。
[0004]本专利技术提出高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法。该突变株基于利用含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达的出发菌株，通过高浓度抗性筛选提高高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株筛选效率。
[0005]本专利技术提出了菌株茂原链霉菌IPIO，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomycesmobaraensis IPIO，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2020196，保藏日期为2020年6月10日。
[0006]本专利技术所述菌株茂原链霉菌IPIO由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得。
[0007]本专利技术还提出了一种出发菌株，即IPIO
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BXL1，其是通过在茂原链霉菌IPIO中整合了含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的质粒表达获得的。
[0008]所述出发菌株IPIO
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BXL1可以用于卡那霉素筛选。
[0009]所述出发菌株IPIO
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BXL1含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达盒。
[0010]进一步的，该菌株由茂原链霉菌IPIO整合了含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达盒的质粒后而获得。
[0011]其中，所述谷氨酰胺转氨酶基因的启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]本专利技术还提出了一种表达盒，所述表达盒含有：谷氨酰胺转氨酶基因的启动子、抗性基因 neo。
[0013]本专利技术还提出了所述表达盒在高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株中的应用。
[0014]本专利技术还提出了利用卡那霉素高效筛选以提高高产谷氨酰胺转氨酶菌株的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
[0015]步骤(1)：通过在茂原链霉菌IPIO中，利用谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因 neo的表达，获得诱变的出发菌种IPIO
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BXL1；
[0016]步骤(2)：通过提高固体培养基中抗生素浓度进行筛选，从而获得筛选效率提高的高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株。
[0017]所述步骤(1)具体包括以下步骤：
[0018](1.1)：设计并构建用于抗性筛选的谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的整合型质粒载体pTDS001；
[0019]其中，所述的整合型质粒载体pTDS001的构建方法是通过PCR扩增得到1008bp的谷氨酰胺转氨酶基因的启动子序列及795bp的抗性基因neo的PCR片段，通过一步组装的方法连入整合型质粒pSET152的XbaI/EcoRI位点。
[0020](1.2)：将第一步构建得到的整合型质粒载体pTDS001(ΦC31整合位点，pSET152衍生)通过接合转移导入受体菌茂原链霉菌IPIO中，在染色体上插入谷氨酰胺转氨酶基因的启动子及其控制抗性基因neo，并通过抗性和PCR验证筛选得到诱变的出发菌种IPIO
‑
BXL1。
[0021]所述步骤(2)具体包括以下步骤：
[0022](2.1)：将出发菌株IPIO
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BXL1涂布在不同卡那霉素的固体培养基上，确定出发菌株 IPIO
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BXL1的抗性；
[0023](2.2)：将出发菌株IPIO
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BXL1的孢子通过ARTP或NTG进行诱变，获得诱变后的孢子。
[0024](2.3)：将诱变后的孢子涂布在更高浓度卡那霉素的固体培养基上进行筛选。
[0025]步骤(2.1)中，所述卡那霉素的浓度为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL和400μg/mL。
[0026]步骤(2.2)中，所述ARTP的诱变条件为设定工作气流量10SLM，以氦气为工作气体，电源功率和处理时间为100W，10s；所述NTG进行诱变的具体条件为使用含有0.1mg/mL和0.2mg/mL的亚硝基胍的50mM Tris
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malate缓冲液处理IPIO
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BXL1的孢子，30℃、200rpm孵育30min，随后加1％硫代硫酸钠混匀终止反应。
[0027]步骤(2.3)中，所述更高浓度指300μg/mL和400μg/mL。
[0028]本专利技术还提出了出发菌株IPIO
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BXL1的构建方法，在茂原链霉菌IPIO中，利用谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达，获得诱变的出发菌种IPIO
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BXL1。
[0029]出发菌株的制备方法包括以下步骤：
[0030]第一步：设计并构建用于抗性筛选的谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的整合型质粒载体pTDS001；
[0031]第二步：将第一步构建得到的整合型质粒载体pTDS001本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菌株茂原链霉菌IPIO，其特征在于，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis IPIO，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCNO：M 2020196，保藏日期为2020年6月10日。2.一种菌株IPIO
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BXL1，其特征在于，所述菌株IPIO
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BXL1通过在如权利要求1所述的茂原链霉菌IPIO中整合了含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的质粒表达获得的。3.如权利要求2所述的菌株IPIO
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BXL1，其特征在于，其为可以用卡那霉素进行筛选的菌株IPIO
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BXL1；和/或，所述谷氨酰胺转氨酶基因的启动子的序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述出发菌株IPIO
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BXL1含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达盒。4.如权利要求3所述的菌株IPIO
‑
BXL1，其特征在于，所述表达盒含有：谷氨酰胺转氨酶基因的启动子、抗性基因neo。5.一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤(1)：通过在如权利要求1所述的茂原链霉菌IPIO中，利用谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达，获得诱变的出发菌种IPIO
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BXL1；步骤(2)：通过提高固体培养基中抗生素浓度进行筛选诱变后的突变菌株，从而获得筛选效率提高的高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：(1.1)设计并构建用于抗性筛选的谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的整合型质粒载体pTDS001；(1.2)将第一步构建得到的整合型质粒载体pTDS001通过接合转移导入受体菌茂原链霉菌IPIO中，在染色体上插入谷氨酰胺转氨酶基因的启动子及其控制抗性基因neo，并通过抗性和PCR验证筛选得到诱变的所述出发菌种IPIO
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BXL1。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：(2.1)将出发菌株IPIO
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BXL1涂布在不同卡那霉素的固体培养基上，确定出发菌株IPIO
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BXL1的抗性；(2.2)将出发菌株IPIO
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BXL1的孢子通过ARTP或NTG进行诱变，获得诱变后的孢子；(2.3)将诱变后的孢子涂布在更高浓度卡那霉素的固体培养基上进行筛选。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述整合型质粒载体pTDS001是通过PCR扩增得到1008bp的谷氨酰胺转氨酶基因的启动子序列及795bp的抗性基因neo的PCR片段，通过一步组装的方法连入整合型质粒pSET152的XbaI/EcoRI位点得到的。9.菌株IPIO
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BXL1的构建方法，其特征在于，所述构建方法为，在茂原链霉菌IPIO中，利用谷氨酰胺转氨酶基因的启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：步国建，步绪亮，白林泉，
申请(专利权)人：江苏东汇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：