增强VOCfamilyprotein基因的表达提高谷氨酰胺转氨酶产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提升谷氨酰胺转氨酶产量的方法，通过增强VOC family protein基因SMDS_2194的转录水平，进而提高谷氨酰胺转氨酶产量的方法。通过在茂原链霉菌C2中，利用人工强启动子kasOp*过量表达内源VOC family protein基因SMDS_2194，得到高产谷氨酰胺转氨酶的突变株TGS102。增强VOC family protein基因SMDS_2194的转录水平可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。本发明专利技术所得的工程菌株TGS102的谷氨酰胺转氨酶发酵终产量在实验室摇瓶水平下较对照菌株提高105.48％。对照菌株提高105.48％。对照菌株提高105.48％。

【技术实现步骤摘要】
protein 基因SMDS_2194的转录水平而获得的。
[0008]进一步的，该类菌株由茂原链霉菌C2过量表达来源于茂原链霉菌C2的VOC familyprotein基因SMDS_2194后获得。
[0009]进一步的，该类菌株通过在茂原链霉菌C2中利用人工强启动子kasOp*过量表达内源的 VOC family protein基因SMDS_2194后获得。
[0010]所述菌株的VOC family protein基因SMDS_2194过量表达。
[0011]“过量表达”指在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的来源于茂原链霉菌C2 的VOC family protein基因SMDS_2194，增强VOC family protein基因SMDS_2194的转录水平。
[0012]所述菌株含有人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的VOC family protein 基因SMDS_2194的表达盒。
[0013]所述表达盒含有人工强启动子kasOp*、VOC family protein基因SMDS_2194、转录终止序列。
[0014]所述VOC family protein基因SMDS_2194的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]本专利技术还提供了一种表达盒，所述表达盒含有：人工强启动子kasOp*、VOC family protein 基因SMDS_2194、转录终止序列。
[0016]本专利技术还提供了所述表达盒在在高效筛选菌株TGS102中的应用。
[0017]本专利技术还提供了一种通过增强VOC family protein基因SMDS_2194的转录水平以提高 TGase发酵水平的方法，包括以下步骤：
[0018]第一步：设计并构建用于过量表达内源VOC family protein基因SMDS_2194的整合型质粒载体pTDS102；
[0019]第二步：利用整合型质粒载体pTDS102(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp* 启动子)，在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的VOC family protein基因 SMDS_2194(来源于茂原链霉菌C2)，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS102；
[0020]第三步：将活化后的VOC family protein基因SMDS_2194过量表达突变株TGS102的孢子接种于种子培养基中，25
‑
35℃、180
‑
220rpm(优选地，30℃、200rpm)的条件下培养20
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24 h(优选地，24h)，以8
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15％(优选地，10％)的接种量转接至发酵培养基中，25
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35℃、180
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220 rpm(优选地，30℃、200rpm)的条件下发酵28
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32h(优选地，28h)，收集发酵液并进行酶活测定。
[0021]所述种子培养基包括：甘油1
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3w/v％，酵母提取物0.5
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1w/v％，鱼粉蛋白胨2
‑
3w/v％， MgSO4·
7H2O 0.1
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0.5w/v％，K2HPO4·
3H2O 0.1
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0.5w/v％，pH 7.4；优选地，为甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO4·
7H2O 0.2w/v％，K2HPO4·
3H2O 0.2w/v％， pH 7.4。
[0022]所述发酵培养基包括：甘油1
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3w/v％，酵母提取物0.5
‑
1w/v％，鱼粉蛋白胨2
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3w/v％， MgSO4·
7H2O 0.1
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0.5w/v％，K2HPO4·
3H2O 0.1
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0.5w/v％，发酵促进剂0.1
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0.3w/v％，pH 7.4；优选地，为甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO4·
7H2O 0.2w/v％， K2HPO4·
3H2O 0.2w/v％，发酵促进剂0.1w/v％，pH 7.4。
[0023]本专利技术还提供了高产谷氨酰胺转氨酶TGase的菌株TGS102的制备方法，包括以下
步骤：
[0024](1)：设计并构建用于过量表达内源VOC family protein基因SMDS_2194的整合型质粒载体pTDS102；
[0025](2)：利用整合型质粒载体pTDS102(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp*启动子)，在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的VOC family protein基因SMDS_2194 (来源于茂原链霉菌C2)，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株 TGS102。
[0026]步骤(1)中，所述的载体pTDS102的构建方法是：通过PCR扩增得到777bp的VOC familyprotein基因SMDS_2194序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3
‑
K*的 NdeI/EcoRI位点。
[0027]本专利技术还提供了一种VOC family protein基因SMDS_2194，所述VOC family protein编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0028]本专利技术还提供了一种用于表达VOC family protein基因SMDS_2194的基因序列，所述基因序列为人工强启动子kasOp*的核苷酸序列或者与启动子kasOp*具有90％以上的同源性的核苷酸序列，所述启动子kasOp*的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0029]本专利技术还提供了质粒载体pTDS102的构建方法，通过PCR扩增得到777bp的VOC familyprotein基因SMDS_2194序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3
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K*的 NdeI/EcoRI位点，得到质粒载体pTDS102。
[0030]本专利技术还提供了所述茂原链霉菌C2在高产筛选谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS102中的应用。
[0031]本专利技术还提供了所述谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS102在提高谷氨酰胺转氨酶发酵产量中的应用。
[0032]本专利技术所涉及的质粒pDR3
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K*已经在SCI数据库文献《Xinjuan Ning,Xinran Wang, Yuanting Wu,Qianjin Kang*and Linquan Bai*:Identification and Engineering of Post
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PKSModificatio本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS102，其特征在于，所述菌株通过增强VOC family protein基因SMDS_2194的转录水平而获得的。2.如权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS102，其特征在于，所述菌株通过在茂原链霉菌C2利用人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的VOC family protein基因SMDS_2194后获得；所用茂原链霉菌C2的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensisC2，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2020194，保藏日期为2020年6月10日。3.如权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS102，其特征在于，所述菌株的VOC family protein基因SMDS_2194过量表达；和/或，所述VOC family protein基因SMDS_2194的序列如SEQ ID NO.1所示。4.如权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS102，其特征在于，所述菌株含有人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的VOC family protein基因SMDS_2194的表达盒。5.如权利要求4所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS102，其特征在于，所述表达盒含有人工强启动子kasOp*、VOC family protein基因SMDS_2194、转录终止序列。6.一种增强VOC family protein基因SMDS_2194的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法，其特征在于，步骤如下：第一步：设计并构建用于过量表达VOC family protein基因SMDS_2194的整合型质粒载体pTDS102；第二步：利用整合型质粒载体pTDS102，在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的来源于如权利要求2中所述的茂原链霉菌C2的VOC family protein基因SMDS_2194，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS102；将培养的VOC family protein基因SMDS_2194过量表达突变株TGS102的孢子接种于种子培养基中，25
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35℃、180
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220rpm的条件下培养20
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24h，以8
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15％的接种量转接至发酵培养基中，25
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35℃、180
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220rpm的条件下发酵28
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32h，收集发酵液并进行酶活检测。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质粒载体pTDS102的构建方法为：通过PCR扩增得到777bp的VOC family protein基因SMDS_2194序列的...

【专利技术属性】
技术研发人员：步国建，武立清，白林泉，
申请(专利权)人：江苏东汇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：