一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用，所述方法包括(1)将样品进行水解，得到含有式(I)所示化合物的水解液；(2)采用液相色谱串联质谱对水解液进行检测；(3)以式(I)所述化合物的质谱信号峰面积对糖胺聚糖羧酸化衍生物标准品的量做标准曲线，根据标准曲线计算样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物的含量。本发明专利技术所涉及的方法通过对糖胺聚糖羧酸化衍生物进行水解，可以稳定得到特定结构的水解产物，该结构可以通过MS检测到并选择其中具有较高质谱丰度的水解产物，因此可以间接计算糖胺聚糖羧酸化衍生物的量。且该检测方法的专属性强、准确度高、精密度好、定量限低、检测限低。检测限低。检测限低。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用


[0001]本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用，尤其涉及一种专属性强、准确度高、精密度好、定量限低、检测限低的用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用。

技术介绍

[0002]现有技术例如CN105744940A和CN111670038A两篇专利公开报道了糖胺聚糖羧酸化衍生物作为药物具有抗肿瘤及抗肿瘤转移活性，具有广泛的应用前景。糖胺聚糖羧酸化衍生物为未分级肝素(UFH)经过两步氧化反应后得到的含有糖醛酸邻二醇结构氧化开环的双羧酸衍生物，其属于肝素衍生物，是一种链状、结构不均一的粘多糖物质。在药物代谢研究中，需要测定生物样品中药物的含量以评价该药物的药物代谢动力学性质。在生物样品中直接检测完整的结构不容易实现，而且由于生物样品中存在多种内源性物质，例如蛋白、磷脂等，常规的多糖测试方法易受到内源性物质的干扰而无法对糖胺聚糖羧酸化衍生物进行定量测定。因此，如何提供一种准确的糖胺聚糖羧酸化衍生物的检测方法，成为了亟待解决的问题。

技术实现思路

[0003]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用，尤其提供一种专属性强、准确度高、精密度好、定量限低、检测限低的用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用。
[0004]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0005]第一方面，本专利技术提供一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法，所述方法包括如下步骤：
[0006](1)将含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品进行水解，得到含有式(I)所示化合物的水解液：
[0007][0008]其中，各R
a
独立地为
‑
SO3H或
‑
H，各R
b
独立地为H、
‑
SO3H或
‑
C(O)CH3，各R
c
独立地为
‑
SO3H或
‑
H，n为0、1、2、3、4或5；
[0009](2)采用液相色谱串联质谱对步骤(1)得到的水解液进行检测；
[0010](3)根据质谱信号峰面积对糖胺聚糖羧酸化衍生物标准品的量做的标准曲线计算
样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物的含量；
[0011]所述糖胺聚糖羧酸化衍生物包含式(II)所示的结构单元和任选的式(III)所示的结构单元：
[0012][0013]其中，各R
a
独立地为
‑
SO3H或
‑
H，R
b
独立地为H、
‑
SO3H或
‑
C(O)CH3，R
c
独立地为
‑
SO3H或
‑
H。
[0014]优选地，所述式(I)所示化合物具有以下结构式中至少一种的结构：
[0015][0016]其中，化合物(a)的质谱信号为MS(ESI,neg.ion)m/z:432.0[M
‑
H]‑
；
[0017]化合物(b)的质谱信号为MS(ESI,neg.ion)m/z:390.0[M
‑
H]‑
；
[0018]化合物(c)的质谱信号为MS(ESI,neg.ion)m/z:522.98[M
‑
2H]2‑
。
[0019]本专利技术所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物包含如上所述式(II)所示的结构单元和任选的式(III)所示的结构单元，即糖胺聚糖化合物中己糖醛酸结构部分或全部开环。
[0020]本专利技术所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物经过水解后可以得到式(I)所示化合物，反应机理如方案1和2所示，其中，各R
a
独立地为
‑
SO3H或
‑
H，各R
b
独立地为H、
‑
SO3H或
‑
C(O)CH3，各R
c
独立地为
‑
SO3H或
‑
H，n为0、1、2、3、4或5：
[0021]方案1：
[0022][0023]方案2：
[0024][0025]在本专利技术所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物的每条多糖链中，各双糖结构单元以任意顺序排列。
[0026]由于糖胺聚糖羧酸化衍生物为非均一物质，在生物样品中直接检测完整的结构不容易实现，因此本专利技术所涉及的检测方法通过水解，可以稳定得到如上所述特定结构的水解产物化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)，该结构可以通过MS检测到并选择具有较高质谱丰度的水解产物，通过测定该水解产物的含量可以间接计算糖胺聚糖羧酸化衍生物的量。且该检测方法的专属性强、准确度高、精密度好、定量限低、检测限低。
[0027]优选地，所述糖胺聚糖羧酸化衍生物的重均分子量为3000
‑
20000Da，例如3000Da、5000Da、7000Da、8000Da、9000Da、10000Da、11000Da、12000Da、13000Da、13500Da、14000Da、16000Da、18000Da或20000Da等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一
赘述。优选7000
‑
14000Da，进一步优选8000
‑
13500Da。
[0028]所述糖胺聚糖羧酸化衍生物的开环度为10
‑
100％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选25
‑
80％，进一步优选25
‑
60％。
[0029]本专利技术中的术语“开环度”是指开环的糖醛酸残基数量与总的糖醛酸残基数量之比，其检测和计算参考文献Guerrini,M.,Guglieri,S,Naggi,A,Sasisekharan,R,(2007).Low molecular weight heparins:Structural differentiation by bidimentional nuclear magnetic resonance spectroscopy.Seminars in Thrombosis and Hemostasis,33,478
‑
487中的核磁方法进行。
[0030]优选地，步骤(1)所述将含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品进行水解的处理方式为加热。
[0031]优选地，所述加热的温度为70
‑
100℃，例如70℃、75℃、80℃、82℃、85℃、87℃、95℃或100℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品进行水解，得到含有式(I)所示化合物的水解液：其中，各R
a
独立地为
‑
SO3H或
‑
H，各R
b
独立地为H、
‑
SO3H或
‑
C(O)CH3，各R
c
独立地为
‑
SO3H或
‑
H，n为0、1、2、3、4或5；(2)采用液相色谱串联质谱对步骤(1)得到的水解液进行检测；(3)根据质谱信号峰面积对糖胺聚糖羧酸化衍生物标准品的量做的标准曲线计算样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物的含量；所述糖胺聚糖羧酸化衍生物包含式(II)所示的结构单元和任选的式(III)所示的结构单元：其中，各R
a
独立地为
‑
SO3H或
‑
H，R
b
独立地为H、
‑
SO3H或
‑
C(O)CH3，R
c
独立地为
‑
SO3H或
‑
H。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(I)所示化合物具有以下结构式中至少一种的结构：少一种的结构：3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖胺聚糖羧酸化衍生物的重均分子量为
3000
‑
20000Da，优选7000
‑
14000Da，进一步优选8000
‑
13500Da；所述糖胺聚糖羧酸化衍生物的开环度为10
‑
100％，优选25
‑
80％，进一步优选25
‑
60％。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述将含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品进行水解的处理方式为加热；优选地，所述加热的温度为70
‑
100℃，优选85
‑
95℃；优选地，所述加热的时间为12
‑
168h，优选12
‑
120h；优选地，所述标准曲线的制作方法为：以糖胺聚糖羧酸化衍生物作为标准品，按照步骤(1)的方法水解其不同梯度浓度的溶液，按照步骤(2)的方法检测不同浓度标准品溶液的水解液中式(I)所示化合物的质谱信号峰面积，以质谱信号峰面积对糖胺聚糖羧酸化衍生物标准品的量做标准曲线。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其特征在于，所述液相色谱为反相色谱、尺寸排阻色谱或亲水色谱；优选地，所述液相色谱的流动相为流...

【专利技术属性】
技术研发人员：王景文，任丽鸽，林森茂，李锂，
申请(专利权)人：深圳市海普瑞药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：