一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用技术

一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法，所述方法包括：将所述低分子肝素用亚硝酸完全降解得到降解产物，以及将所述降解产物经高效液相色谱(HPLC)联用电雾式检测器(CAD)进行检测。此方法无需衍生和脱乙酰步骤，降解产物制备时间短、分析成本低、检测准确率高。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用
本专利技术涉及一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用。
技术介绍
达肝素钠是一种低分子肝素钠，由不同分子量的多糖链组成，其本身在紫外没有吸收峰。肝素酶，不论是肝素酶I、II或III，它们都是特异性裂解葡萄糖胺(1-4)己糖醛酸间相连的糖苷键，并在己糖醛酸的C4与C5间形成一个双键。肝素酶酶解达肝素钠后所得的酶解产物能够在紫外具有吸收峰，可通过紫外检测器对达肝素钠的酶解产物进行定量分析。为了检测达肝素钠的质量，常用肝素酶酶解达肝素钠，然后用液相系统对降解产物进行分离，并通过与市售的二糖标准品比对保留时间进行定性，再通过各二糖标准品对检测器响应值和物质量的标准曲线进行定量。由于二糖标准品比较昂贵，所以后续发展出通过高效液相系统对降解产物进行分离，然后进一步对分离的产物通过质谱仪进行结构表征，从而实现对达肝素钠降解产物的定性分析，利用紫外检测器对分离出的各个组分进行定量分析，最终实现对达肝素钠质量的分析。为了进一步提升对肝素酶酶解组分的定性/定量分析的方法，现有技术常在肝素酶酶解达肝素钠产物上柱前或后，进行衍生反应，例如：现有技术(CN201310711455.X)公开了在肝素酶酶解达肝素钠后，上液相系统柱子分离之前，对酶解产物进行衍生，并用反相色谱与高分辨质谱联用对衍生产物进行检测，以保证所有酶解产物均能进行定性分析。现有技术(CN201410123609.8)公开了在肝素酶酶解达肝素钠液相系统柱子分离酶解产物之后，进行荧光衍生反应，然后再进行检测。这既为无紫外吸收的低分子量肝素组分提供可检测的荧光基团，又可以实现高灵敏度的荧光检测，谱图中样品响应值更高；避免了衍生反应的副产物对色谱分离造成的干扰，提高分析的准确性和重复性。另外，为了避免肝素酶降解的局限性，现有技术(CN201310695114.8)中还存在检测肝素二糖组成的方法，其主要是先将肝素脱乙酰化，得到脱乙酰肝素，然后将脱乙酰肝素用亚硝酸降解，得肝素二糖；将肝素二糖浓缩至干后溶于水，调pH值至碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；用液相色谱法或液相色谱质谱联用法检测衍生后的二糖。关于现有技术中使用脱乙酰化后然后进行脱乙酰肝素亚硝酸降解法，它能够降解达肝素钠中带有N-硫酸基的葡萄糖胺，但不能降解达肝素钠中带有的N-乙酰基的葡萄糖胺。也就是说，脱乙酰步骤使得达肝素钠中存在的含有N-乙酰基的葡萄糖胺信息消失，且该方法还必须含有衍生步骤，步骤繁琐。关于现有技术中肝素酶降解法，首先肝素酶易失活且性质不稳定，其次肝素酶酶解达肝素钠需要的时间长(单酶解实验所需时间为48h)、步骤繁琐、检测成本高(需要使用质谱)。同时，用酶解降解达肝素钠时，葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)脱水后形成结构相同的脱水的糖醛酸，失去了达肝素钠中葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸的含量和结构信息，且肝素酶不能完全将达肝素钠降解为二糖。在现有技术中，对达肝素钠降解产物的分析方法效率低下、成本高且对达肝素钠降解产物的分析方法所得结果不能完整体现被分析的达肝素钠的情况。因此，目前存在对分析时间短、分析成本低、检测准确率高且完整体现被分析的达肝素钠的情况的分析方法的需求。
技术实现思路
在本专利技术的第一方面，涉及一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法，所述方法包括下述步骤：(1)将所述达肝素钠与亚硝酸混合被完全降解；(2)将降解产物经高效液相色谱联用电雾式检测器进行检测。在一些实施方式中，所述步骤(1)还包括在所述达肝素钠与亚硝酸混合被完全降解后，加入pH调节剂终止反应，然后加入硼氢化钠溶液还原，进一步加入一种或多种pH调节剂终止反应且调节pH至中性，得到最终降解产物。在一些实施方式中，在所述步骤(2)中，所述高效液相色谱和电雾式检测器的条件是流速0.1-2mL/min；洗脱梯度为0-45min，10％-60％流动相A，90％-40％流动相B，其中所述流动相A是铵盐溶液且所述流动相B是乙腈。在一些实施方式中，所述铵盐是醋酸铵或甲酸铵，其浓度是20-200mM，且所述流速为0.1-1mL/min，且所述洗脱梯度为0-45min，10％-45％流动相A，90％-55％流动相B。在一些实施方式中，所述达肝素钠的质量与所述亚硝酸摩尔数的比值(g/mol)是17.5-405:1，优选为25-250:1、35-175:1、50-130:1。在一些实施方式中，在与亚硝酸混合后所述达肝素钠的浓度在4mg/mL-150mg/mL。在一些实施方式中，所述pH调节剂选自下述的一种或多种：碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸和冰醋酸。在一些实施方式中，所述方法任选包括下述步骤：将步骤(2)所得检测结果与达肝素钠被亚硝酸完全降解后的产物经超高效液相色谱联用质谱进行检测的结果进行比对，最终获得步骤(1)所述达肝素钠经亚硝酸降解后的产物的定性和定量信息。在本专利技术的第二方面，涉及所述分析方法在达肝素钠质量检测中的应用。在一些实施方式中，所述应用包括使用所述分析方法对达肝素钠标准品(包括但不限于欧洲或美国标准品)和/或原研样品进行多次检测，根据检测结果建立质量标准。附图说明图1显示空白溶液和Dal-USP-RED-02叠图，上图为Dal-USP-RED-02，下图为BLANK-RED。图2显示Dal-USP-RED-01和Dal-USP-RED-02叠图，上图为Dal-USP-RED-02，下图为Dal-USP-RED-01。图3显示Dal-USP-RED-03和Dal-USP-RED-04叠图，上图为Dal-USP-RED-04，下图为Dal-USP-RED-03。图4显示Dal-USP-RED-04至Dal-USP-RED-08叠图。图5显示样品检测结果示图。图6显示空白溶液、达肝素钠标准品和达肝素钠原研样品叠图，由下往上分别为专属性-BLANK-RED、专属性-Dal-USP-RED-01、专属性-Dal-EP-RED-01、专属性-原研样品-RED-01。图7显示空白溶液、达肝素钠标准品和达肝素钠原研样品叠图，由下往上分别为BLANK-RED、Dal-USP-RED-01、Dal-EP-RED-01、原研样品-RED-01。定义如本文所使用的，术语“室温”是指25℃±5℃。同时，若没有具体指明实验温度，均为室温。如本文所使用的，术语“约”是指该术语所修饰的数值的±20％，优选为±10％，更优选为±5％，因此本领域的普通技术人员能够清楚地根据所修饰的数值确定术语“约”的范围。如本文所使用的，术语“达肝素钠标准品”是指包括但不限于美国药典和欧洲药典的达肝素钠标准品。如本文所使用的，术语“达肝素钠原研样品”是指原研厂家辉瑞的达肝素钠上市产品，包括但不限于美国和欧洲的达肝素钠上市产品。如本文所使用的，术语“峰面积百分比％”是指经高效液相色谱与电雾式检测器联用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法，所述方法包括下述步骤：/n(1)将所述达肝素钠与亚硝酸混合被完全降解；/n(2)将降解产物经高效液相色谱联用电雾式检测器进行检测。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180724 CN 2018108195843一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法，所述方法包括下述步骤：
(1)将所述达肝素钠与亚硝酸混合被完全降解；
(2)将降解产物经高效液相色谱联用电雾式检测器进行检测。


根据权利要求1所述的分析方法，其中所述步骤(1)还包括在所述达肝素钠与亚硝酸混合被完全降解后，加入pH调节剂终止反应，然后加入硼氢化钠溶液还原，进一步加入一种或多种pH调节剂终止反应且调节pH至中性，得到最终降解产物。


根据权利要求1或2所述的分析方法，其中在所述步骤(2)中，所述高效液相色谱和电雾式检测器的条件是流速0.1-2mL/min；洗脱梯度为0-45min，10％-60％流动相A，90％-40％流动相B，其中所述流动相A是铵盐溶液且所述流动相B是乙腈。


根据权利要求3所述的分析方法，其中所述铵盐是醋酸铵或甲酸铵，其浓度是20-200mM，所述流速为0.1-1mL/min，且所述洗脱梯度为0-45min，10％-45％流动相A，90％-55％流动相B。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗君君，石瑛，林森茂，陈永杰，李锂，
申请(专利权)人：深圳市海普瑞药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44