一种重组人胰高糖素样肽-1及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及一种重组人胰高糖素样肽

【技术实现步骤摘要】
一种重组人胰高糖素样肽
‑
1及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体地，涉及一种重组人胰高糖素样肽
‑
1及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]糖尿病是由于人体血液中葡萄糖长期堆积过多所造成，有很强的遗传性和环境因素影响。随着现代人类饮食结构的变化和生活节奏的加快，全球糖尿病的发病率增长迅猛，已成为继肿瘤、血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性代谢性疾病。
[0003]人胰高糖素样肽
‑
1(GLP
‑
1)能刺激胰β细胞增殖，促进胰岛再生，同时抑制胰β细胞的凋亡，并能促进胰β细胞合成胰岛素。动物试验和临床试验均表明Ⅱ型糖尿病病人给予GLP
‑
1后血糖水平显著降低，且无胰岛素和磺脲类降糖药的低血糖危险。GLP
‑
1独特的降血糖作用机制与众不同，是现有抗糖尿病药物无可比拟的，但其非常短的体内半衰期大大限制了其应用。影响GLP
‑
1应用的主要因素主要有以下3个方面：(1)GLP
‑
1核苷酸序列为TTTATTGCATGGTTAGTTAAAGGTCGTGGT，氨基酸序列为FIAWLVKGRG，分子量非常小，仅为1.15kDa，因此大肠杆菌原核表达系统难以表达；(2)因为分子量比较小，在代谢过程中极易被肾小球滤过；(3)体内半衰期短，限制其应用。
[0004]节肢蛋白(resilin)是一种在昆虫节肢中发现的水溶性弹性蛋白，其由具有高度灵活性和流动性的随机定向卷曲多肽链网络组成，多肽链间通过二酪氨酸和三酪氨酸以共价交联的方式有规律地间隔连接在一起。由于这种稳定的结构，使其具有刚度低、拉伸应变强、持久性强等优异的力学性能，提供低刚度、高应变和高效能源储存，尤其在昆虫飞行、跳蚤和八角虫跳跃起到重要作用。Resilin具有耐高温，对众多的变性剂如尿素、盐酸胍都不会降解。Resilin蛋白具有的热稳定性和冷却凝集特性，只需经过盐析加热离心等过程就能获得目标蛋白，使蛋白的纯化方法简化，具有良好的应用前景。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在不足，本专利技术提供了一种重组人胰高糖素样肽
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1及其构建方法和应用。本专利技术中，通过将GLP
‑
1和ARP连接，构建出重组GLP
‑
1的GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP，所述重组GLP
‑
1能够在大肠杆菌原核表达系统表达；自我高效纯化；可提高GLP
‑
1稳定性延长药物的半衰期，增加药物在组织内的停留时间，提高降血糖效果。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的第一方面提供一种重组人胰高糖素样肽
‑
1GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP，所述GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]本专利技术的第二方面提供上述重组人胰高糖素样肽
‑
1的构建方法，所述构建方法为将GLP
‑
1与ARP通过接头Linker连接，得到重组GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP。
[0008]具体地，所述GLP
‑
1氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。所述ARP为模拟人工节肢蛋白多肽，为27个肽(PSSSYGAPGGGNGGRPSDSYGAPGGGN，
SEQ ID NO:9)的10个重复序列组成的模拟树脂蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。所述接头Linker为连接肽，由10个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0009]本专利技术的第三方面提供一种重组表达质粒pET22b
‑
GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP，所述pET22b
‑
GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP包括载体pET22b片段和所述的GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP。所述pET22b可商购获得。
[0010]本专利技术的第四方面提供一种含有所述的重组表达质粒的重组菌。所述重组菌优选为大肠杆菌，例如大肠杆菌BL21。
[0011]本专利技术的第五方面提供一种制备重组人胰高糖素样肽
‑
1的方法，所述方法为发酵培养所述的重组菌，得到人胰高糖素样肽
‑
1。具体地，所述方法包括LB培养基中于25℃添加0.4mM的IPTG诱导培养。
[0012]根据本专利技术，该方法还包括对人胰高糖素样肽
‑
1纯化的步骤，具体地，所述纯化方法为冷却凝集纯化，例如采用4℃冷却凝集方法纯化所述人胰高糖素样肽
‑
1。
[0013]本专利技术的第六方面提供所述的重组人胰高糖素样肽
‑
1GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP在制备降血糖药物中的作用。
[0014]通过对Resilin蛋白序列分析，发现所有昆虫的Resilin序列都包含Tyr
‑
Gly
‑
Ala
‑
Pro(YGAP)保守序列。本专利技术根据保守序列，优化并人工设计了具有树脂蛋白功能的模拟人工节肢蛋白多肽(Artificial resilin polypeptide，ARP)。ARP为PSSSYGAPGGGNGGRPSDSYGAPGGGN的10个重复序列组成，利用该多肽融合表达外源多肽GLP
‑
1，解决了(1)GLP
‑
1氨基酸太短，无法在大肠杆菌表达系统表达；(2)利用冷却凝集特性，高效纯化融合蛋白；(3)表达的融合蛋白具有提高代谢稳定性，延长药物的半衰期，增加药物在组织内的停留时间，实现长效以减少给药频率。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0016]本专利技术中，在GLP
‑
1连接ARP，使GLP
‑
1具有的热稳定性和冷却凝集性，这种特性使蛋白只需经过冷却凝集简单的纯化过程就能获得目标蛋白，避免了亲和色谱层析法繁琐的实验过程。通过该特性可以实现GLP
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1的纯化，得到更高的纯化倍数，此外增加GLP
‑
1稳定性。
[0017]本专利技术通过基因修饰技术使GLP
‑
1连接ARP，构建了GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP重组人胰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人胰高糖素样肽
‑
1GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP，其特征在于，所述GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.权利要求1所述的重组人胰高糖素样肽
‑
1的构建方法，其特征在于，所述构建方法为将GLP
‑
1与ARP通过接头Linker连接，得到重组GLP
‑1‑
Linker
‑
ARP。3.根据权利要求2所述的人胰高糖素样肽
‑
1的构建方法，其特征在于，所述GLP
‑
1氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述ARP为模拟人工节肢蛋白多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述接头Linker为连接肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：张焕新，祁兴普，郑义，李若敏，叶静静，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：