一种膜锚定式IL-15超级复合物的研制及其在肿瘤免疫细胞治疗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤免疫治疗领域，是一种膜锚定式IL

【技术实现步骤摘要】
一种膜锚定式IL
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15超级复合物的研制及其在肿瘤免疫细胞治疗中的应用


[0001]本专利技术涉及免疫细胞肿瘤治疗领域，具体涉及一种膜锚定式IL
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15超级复合物的研制及其在肿瘤免疫治疗方面的应用。

技术介绍

[0002]过继性免疫细胞治疗是继手术、化疗、放疗和靶向疗法之后，当前生物医药领域内一种新型的抗肿瘤治疗手段。该方法主要通过采集患者自身的免疫细胞，经体外修饰、活化、培养及扩增后，增强细胞的靶向性杀伤功能，再回输到患者体内，通过增强机体的免疫系统功能从而到达杀死和消灭肿瘤细胞的目的。目前，过继性免疫细胞治疗主要包括CAR
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T、LAK、CIK、DC、NK和TCR等，其中最受瞩目的当属 CAR
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T细胞免疫疗法。CAR
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T(Chimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受体T细胞)，它是通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞，仅在接触TAA时才能激活T细胞的杀伤作用，连续杀伤和生成细胞因子。肿瘤免疫细胞疗法经过近几年的发展，在临床上获得了突破性进展，尤其是靶向CD19抗原的CAR
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T细胞，在血液肿瘤和淋巴瘤方面疗效显著，在某些患者中获得了完全缓解。这种持久性与CAR T细胞的长期免疫监视直接相关。一旦在免疫应答中清除了抗原，免疫细胞的作用将会消失。因此，目前肿瘤免疫细胞治疗技术依然存在诸多临床瓶颈。已有大量研究表明，接受治疗的患者在达到完全缓解后，1年内的复发率高达46％。通过对患者回输后的免疫细胞亚群和回输的CAR
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T细胞进行分析显示，产品中Tcm和Tscm的比例以及回输后受试者体内Tcm和Tscm的比例与缓解时间和CAR
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T抗肿瘤活性的维持性呈现正相关。患者输注的CAR
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T细胞中CAR阳性T细胞中Tcm和Tscm的比例越高，患者获得长期缓解的可能性越大。临床前动物实验也表明，回输Tcm为主要亚群的CAR
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T细胞可以显著延长小鼠的生存时间。目前已知的Tcm制备方法是从外周血中分离原代初始型T细胞，而TSCM仅占外周血单核细胞(PBMC)的一小部分(2
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3％)，即使通过体外扩增，也很难满足临床需求。
[0003]IL
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15是一种多效细胞因子，与IL
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2具有类似的生物学功能，不仅能激活T细胞、B细胞和NK细胞，并可介导这些细胞的增殖和存活，还能激活、维持和扩增CD8+记忆性T细胞，保持T细胞的干性。不会促进诱导活化的T细胞凋亡，也不会促进Treg增殖，且CD8+T细胞对IL
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15极度敏感。因此，IL
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15是抗肿瘤的极佳选择。
[0004]IL
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15Rα是IL
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15的高亲和力受体，它首先与细胞表面IL
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15结合，IL
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15/IL
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15Rα复合物最终必须与另外两个受体亚基即IL
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15Rβ/IL
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2R亚基和γC亚基发生结合后才能刺激T淋巴细胞的增殖。IL
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15/IL
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15Rα复合物与IL
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15Rβ/IL
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2R亚基和γC亚基主要通过两种方式：一是在激活的单核细胞等细胞表面形成的 IL
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15/IL
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15Rα复合物，通过“反式”递呈方式将IL
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15递呈给临近表达IL
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15Rβ/IL
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2R和γC受体的靶细胞，即将IL
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15从一个细胞“递呈”给另一个细胞。另一种方式是IL
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15Rα将IL
‑
15“顺式”递呈给表达 IL
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15Rβ/IL
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2R和γC受体的同一个细胞，在同一个细胞内进行信号传导。其中，反式递呈最为重要。然而，反
式递呈机制要求一个细胞将其细胞膜结合的IL
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15/IL
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15Rα复合物递呈给另一个表达IL
‑
15Rβ/IL
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2R和γC受体的靶细胞，实际是“细胞”与“细胞”间的相互作用，这种方式要求一个细胞必须与另一个细胞发生接触才能产生作用，这既是机体免疫系统调控之所需，也在一定程度上制约了利用IL
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15/IL
‑
15Rα复合物进行相关疾病(如肿瘤、感染)的免疫治疗。
[0005]因此，如何利用基因工程技术让细胞产生膜锚定式IL
‑
15超级复合物是一个具有科学价值并值得深入探讨的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供膜锚定式IL
‑
15超级复合物，用于免疫细胞治疗。此超级复合物不仅能在细胞膜表面持续表达，且包含“自杀基因”R结构，分子量小，极大的促进免疫细胞的增殖和存活，提高免疫细胞的干性及活力，确保产品的安全。
[0007]为了解决上述问题，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]具体的，所述的IL
‑
15超级复合物包括信号肽、“自杀基因”R结构、IL
‑
15的突变体IL
‑
15
‑
M
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N72D、 IL
‑
15Rα的“Sushi”结构域、以及CD4分子支架，所述复合体通过2A连接肽与外源插入基因片段连接。
[0009]所述的R结构是一段CD20表位多肽，其表达于细胞表面可在体内被利妥昔单抗通过CDC和ADCC 形式被清除。
[0010]所述的IL
‑
15超级复合物中的IL
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15的突变体IL
‑
15
‑
M
‑
N72D和IL
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15Rα的“Sushi”结构域通过连接肽(Linker)连接；
[0011]所述的IL
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15超级复合物用CD
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4跨膜区作为支架将其锚定在细胞膜上；
[0012]所述的IL
‑
15超级复合物与外源插入基因片段连接所用的2A连接肽为P2A或F2A；
[0013]具体的，所述的IL
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15超级复合物包括：“自杀基因”R结构、Linker1、白细胞介素
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15突变体 IL
‑
15
‑
M
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N72D、Linker2、IL
‑
15Rα的“Sushi”结构域、CD
‑
4跨膜区，并按顺序连接；
[0014]所述的信号肽为CD8、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种膜锚定式IL
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15超级复合物，其特征在于：所述的IL
‑
15超级复合物包括顺序连接的信号肽、“自杀基因”R结构、连接肽1、IL
‑
15的突变体IL
‑
15
‑
N72D、IL
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15Rα的“Sushi”结构域、连接肽2及CD4分子跨膜区的最小结构单元，所述的IL
‑
15复合物通过“CD4”支架锚定在细胞膜上。2.根据权利要求1所述的膜锚定式IL
‑
15超级复合物，其特征在于，所述“自杀基因”R结构是一段CD20表位多肽，其表达于细胞表面可在体内被利妥昔单抗通过CDC和ADCC形式被清除，R结构的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示；所述IL
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15突变体IL
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15
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N72D的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示；IL
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15Rα的“Sushi”结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的序列；所述CD4跨膜区分子支架的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的序列：优选的，所述连接肽为(GxSy)n，其中：G为甘氨酸，S为丝氨酸，x为1、2、3或4，y为1、2、3或4，n为1、2、3、4、5或6。3.根据权利要求1
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2所述的一种膜锚定式IL
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15超级复合物，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示的序列；优选的，“连接肽1”的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，“连接肽2”的氨基酸序列为SEQ ID NO：7。4.载体，其特征在于：包含权利要求1
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3中所述的膜锚定式IL
‑
15超级复合物，优选为...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振宇，何伟杰，何连君，
申请(专利权)人：皖南医学院第一附属医院皖南医学院弋矶山医院，
类型：发明
国别省市：