【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫细胞制备。涉及一种膜锚定式dr-18复合物的研制及其在免疫细胞治疗中的应用。
技术介绍
1、近年来，过继性细胞免疫治疗(adoptive cell therapy，act)在恶性肿瘤治疗中发展如火如荼，包括car-t在内的众多免疫细胞技术在治疗中取得显著进展，并被视为最有望攻克肿瘤的技术之一，具有十分广阔的临床应用前景。以靶向cd19为代表的car-t，已经在血液肿瘤方面取得一定进展。自2017年美国fda批准全球首个car-t治疗产品kymriah以来，截止到今年4月，国内外共上市7款car-t药物，包括在中国获批的阿基仑赛和瑞基奥伦注射液。act是指从患者体内分离出具有活性的免疫细胞，在体外进行改造(或不改造)和扩增，重新输入到患者体内以达到治疗疾病(以肿瘤为主)的目的，主要包括自体淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine active killer cell，lak)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell，cik)、自然杀伤细胞(natural killer cell，nk)、肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，til)、树突细胞(dendritic cell，dc)疫苗、t细胞受体修饰的t细胞(t cell receptor-gene engineered t cell，tcr-t)、嵌合抗原受体修饰的t细胞(chimeric antigen receptor t-cell，car-t)和nk细胞(chimer
2、il-18，因其具有强烈的诱导细胞产生γ干扰素(ifn-γ)功能，开始被称为干扰素诱导因子(ifn-γinducing factor,igif)，随后发现其还有促进粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)的产生和降低il-10的产生等功能，被重新命名为il-18，归属于il-1超家族。il-18在细胞内以非活性前体方式(pro-il-18)大量存在于上皮细胞、巨噬细胞和树突细胞中，在炎症发生时被重组的nlrp3炎症小体组分caspase-1切割成为活性il-18迅速释放。il-18通过结合其异源二聚体受体(il-18rα/rβ)介导myd88-nfκb信号通路，调节基因转录。由于其受体在免疫细胞上的高表达，il-18因此能够刺激t、nk、til等免疫细胞分泌产生ifn-γ，特异性杀伤肿瘤细胞。有研究表明，il-18作为一种重要的免疫调节细胞因子，可改善免疫细胞的功能，而不会造成严重的剂量限制性毒性。介于il-18在免疫调控中的强大功能，其在肿瘤免疫方面中的应用被广泛研究。研究显示，将il-18与免疫细胞疗法联合，与其他细胞因子相比，il-18表现出了更强大的抗肿瘤效应，且毒副作用更低。
3、但由于肿瘤细胞大量表达抑制性的il-18decoy受体——il-18bp，il-18bp是一种分泌型拮抗剂，能以极高的亲和力(kd<1nm)结合il-18，这种竞争性结合使得免疫细胞无法激活il-18通路，从而限制免疫细胞分泌产生ifn-γ，无法特异性杀伤肿瘤细胞。dr-18是il-18的一种突变体，仅结合il-18rα而对il-18bp亲和力极低(kd＝10.5μm)，能够保持il-18原有的信号激活功能而不被il-18bp抑制。dr-18在多种小鼠肿瘤模型中均显示出良好的抗肿瘤活性，其单独疗效甚至优于抗pd-1单药治疗。与野生型il-18相比，dr-18解除体内来自il-18bp抑制，通过结合il-18rα激活下游通路，最终重塑tme，增强t和nk细胞肿瘤持续性杀伤功能。
4、利用dr-18作为一种治疗策略，已有相关药物在研发过程中，但仍存在一些问题，一是直接应用无法避免其他细胞的过度激活，具有潜在未知风险；二是增加药物治疗成本，加重患者负担。
5、本专利技术针对细胞疗法中免疫细胞增殖能力弱、持久性差而导致对肿瘤细胞杀伤不足的问题，以及野生型il-18与il-18bp高亲和力结合而无法激活下游通路的问题，提供一种膜锚定式dr-18复合物，从而更安全、有效地杀伤肿瘤细胞。
技术实现思路
1、本专利技术利用基因工程策略，设计了一种膜固定式dr-18复合物，串联起信号肽、il-18突变体dr-18、il-18受体il-18rα膜蛋白，再将其与免疫细胞治疗技术如car-t/car-nk/til等细胞疗法联合起来，从而进一步增强包括car-t细胞在内的免疫细胞的增殖与功能，更安全、有效的杀伤肿瘤细胞。本专利技术相较于dr-18单体药物，具有如下优势：(1)通过il-18受体il-18rα膜蛋白，将dr-18锚定在细胞膜上，使其有效且特异性地靶向car-t/car-nk/til等免疫细胞及其周围肿瘤微环境，仅局限于肿瘤部位发挥作用，避免dr-18分泌扩散而过度激活其他不相关细胞；(2)不需要外源加入细胞因子il-18，从而降低细胞培养和患者用药的成本。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、一种dr-18复合物，包含信号肽、il-18突变体dr-18、il-18受体il-18rα膜蛋白并按顺序连接。
4、所述的信号肽为cd4信号肽、cd8信号肽、cd28信号肽或轻链信号肽。
5、优选的，所述信号肽为cd8信号肽。
6、具体的，所述cd8信号肽，其氨基酸序列为seq id no：1(dmwtwilflvaaatrvhs)所示的序列；
7、具体的，所述il-18突变体dr-18的氨基酸序列为seq id no：2
8、(hfgrlhcttavirnindqvlfvdkrqpvfedmtdidqsasepqtrliiyaygdsrar gkavtlsvkdskmstlscknkiisfeemdppeniddiqsdliffqkrvpghnkmefess lyeghflacqkeddafklilkkkdengdksvmftltnlhqs)所示的序列。
9、所述的dr-18复合物中的il-18受体il-18rα膜蛋白去除自身信号肽片段，和il-18突变体dr-18连接。
10、所述的dr-18复合物以il-18受体il-18rα膜蛋白将其锚定在细胞膜上。
11、具体的，所述il-18受体il-18rα膜蛋白的完整氨基酸序列为seq id no：3
12、(mncrelpltlwvlisvstaesctsrphitvvegepfylkhcscslaheietttkswy kssgsqehvelnprsssrialhdcvlefwpvelndtgsyf本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种膜锚定式DR-18复合物，其特征在于，其由信号肽、IL-18突变体DR-18和IL-18受体IL-18Rα膜蛋白通过接头依次串联连接，其中，IL-18突变体DR-18的氨基酸序列为SEQ IDNO：2所示的序列，IL-18受体IL-18Rα膜蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的序列。
2.根据权利要求1所述的DR-18复合物，其特征在于，所述信号肽选自CD4信号肽、CD8信号肽、CD28信号肽或轻链信号肽。
3.根据权利要求1-2任一项所述的DR-18复合物，其特征在于，信号肽为CD8信号肽，如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求3所述的DR-18复合物，其特征在于，所述信号肽通过接头1与IL-18突变体DR-18连接，接头1的氨基酸序列为SEQ ID NO：6；所述的IL-18突变体DR-18通过接头2与IL-18受体IL-18Rα膜蛋白连接，接头2的氨基酸序列为SEQ ID NO：9。
5.一种工程改造免疫细胞，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的DR-18复合物。
6.权利要求5所
7.权利要求5-6任一项所述的工程改造免疫细胞，其特征在于，将DR-18复合物通过P2A连接肽与工程改造免疫细胞胞内结构域连接，P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
8.权利要求1-4任一项所述的DR-18复合物、权利要求5-7任一项所述的工程改造免疫细胞在制备肿瘤免疫药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，所述肿瘤为血液瘤或实体瘤。
10.根据权利要求9所述的应用，所述肿瘤为人淋巴瘤。
...【技术特征摘要】
1.一种膜锚定式dr-18复合物，其特征在于，其由信号肽、il-18突变体dr-18和il-18受体il-18rα膜蛋白通过接头依次串联连接，其中，il-18突变体dr-18的氨基酸序列为seq idno：2所示的序列，il-18受体il-18rα膜蛋白的氨基酸序列为seq id no：4所示的序列。
2.根据权利要求1所述的dr-18复合物，其特征在于，所述信号肽选自cd4信号肽、cd8信号肽、cd28信号肽或轻链信号肽。
3.根据权利要求1-2任一项所述的dr-18复合物，其特征在于，信号肽为cd8信号肽，如seq id no：1所示。
4.根据权利要求3所述的dr-18复合物，其特征在于，所述信号肽通过接头1与il-18突变体dr-18连接，接头1的氨基酸序列为seq id no：6；所述的il-18突变体dr-...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐振宇，邵慧敏，周凌婕，
申请(专利权)人：皖南医学院第一附属医院皖南医学院弋矶山医院，
类型：发明
国别省市：
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