针对铜绿假单胞菌OprF蛋白的抗体、其作为药物的用途和含有该抗体的药物组合物制造技术

本发明专利技术涉及针对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)OprF蛋白的单克隆抗体或该抗体的功能片段。该抗体或抗体片段特别可用于对铜绿假单胞菌感染的预防性或治愈性治疗。性治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对铜绿假单胞菌OprF蛋白的抗体、其作为药物的用途和含有该抗体的药物组合物
[0001]本专利技术涉及治疗细菌感染，特别是例如由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)物种的细菌引起的那些的感染的领域。
[0002]更具体地，本专利技术涉及针对铜绿假单胞菌的OprF蛋白的单克隆抗体或该抗体的功能片段。本专利技术还涉及编码这种抗体或抗体片段的核酸分子、包含这种核酸分子的表达载体和包含这种核酸分子或这种表达载体的宿主细胞。本专利技术还涉及用于制备根据本专利技术的抗体或抗体片段的方法，以及该抗体或抗体片段作为药物，特别是用于预防性或治愈性治疗铜绿假单胞菌感染的用途。本专利技术还涉及含有这种抗体或抗体片段的药物组合物。本专利技术还涉及根据本专利技术的抗体或抗体片段用于检测从个体获得的体液中的铜绿假单胞菌细菌的用途，以及用于这种检测的试剂盒，其含有这种抗体或抗体片段。
[0003]医院获得性感染的预防和治疗是在医院部门中的主要关注点。这些感染的发生率正在稳步提高，特别是因为导致这些感染的病原体对抗生素的抗性越来越强。
[0004]在医院环境中，铜绿假单胞菌细菌尤其是医院获得性感染以及肺炎的主要原因之一。据估计，铜绿假单胞菌导致10％的医院获得性疾病。受这种病原体影响的人数非常多，而且免疫防御受损的人的相关死亡率很高。铜绿假单胞菌是机会性细菌，其尤其参与了在人工通气下的患者和患有囊性纤维化患者的急性和慢性感染，并且其导致免疫低下患者(包括移植患者和严重烧伤患者)中的败血症。
[0005]导致医院获得性感染的铜绿假单胞菌菌株的特征在于对广泛多种抗生素和常规抗生素治疗具有内在抗性。由于这种抗生素抗性及其在患者肺部形成生物膜的能力，这种细菌很难被消除。
[0006]然而，尽管这种病原体广泛传播和抗生素抗性菌株的数量不断增加，但迄今为止，制药行业针对铜绿假单胞菌感染还未有任何有效的治疗。
[0007]现有技术已经设想了不同的治疗方法来开发这种治疗。
[0008]由于最近对细菌毒力机制的研究(Chevalier et al.，2017，FEMS，41：698
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722)，已在铜绿假单胞菌中鉴定出一定数量的免疫原性蛋白。这些研究表明，这些免疫原主要位于某些结构区室中，例如鞭毛、菌毛、脂多糖、外膜蛋白，或形成分泌产物的一部分，例如黏液胞外多糖、外毒素A和蛋白酶。在外膜蛋白中，孔蛋白OprF和OprI一直是实证研究的对象(Chevalier et al.，2017，FEMS，41：698
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722)。已经通过融合产生了含有这些蛋白质的已知表位的杂合蛋白质，并在动物模型中进行了测试(Weimer et al.，2009，Infect.Immun.，77(6)：2356
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2366)。
[0009]现有技术设想的另一种治疗方法是基于靶向所有铜绿假单胞菌菌株中保守的分子靶标的抗体的用途。因此，目前正在研究三种抗体：靶向III型分泌系统的抗PcrV(Shionogi et al.，2016，Hum Vaccin Immunother.12(11)：2833
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2846)，使得可以杀伤细菌并募集先天免疫系统效应物的抗LPS抗体，以及靶向PcrV和PsI方法的双特异性抗体。
[0010]然而，虽然目前正在开发和测试数种治疗方法，但仍必须出现用于治疗铜绿假单胞菌感染的新解决方案，以解决铜绿假单胞菌感染所代表的重要公共卫生问题。
[0011]因此，本专利技术的目的是提供使得其可以有效地对抗细菌感染，特别是铜绿假单胞菌感染的治疗剂，其解决了与铜绿假单胞菌抗生素抗性相关的问题以及与缺乏针对这种导致医院获得性感染和作为患有囊性纤维化患者死亡的主要原因的传染源的有效治疗相关的问题。
[0012]为此，本专利技术人寻求开发新型抗感染抗体类型的活性剂，并为此，本专利技术人更具体地专注于作为分子靶标的膜蛋白OprF，其也称为孔蛋白OprF。OprF蛋白是具有大直径传导孔的高度丰富的38kDa蛋白，其参与多种不同的功能，并且在所有铜绿假单胞菌菌株中高度保守(Genbank登录号：AFM37279.1)。如现有技术所述，OprF蛋白在铜绿假单胞菌毒力中的重要作用使其成为抗感染治疗的潜在靶标。
[0013]现有技术已经提出了靶向铜绿假单胞菌的OprF蛋白的抗体，特别是通过文件WO2016/033547，Moon et al.，Investigative Ophthalmology & Visual Science，1988，29：1277
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1284以及Rawling et al.，1995，Infection and Immunity，63：38
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42所举例说明的。然而，这些抗体是通过接种可溶性OprF蛋白片段或使用去污剂溶解的完整OprF蛋白(即以与细菌膜中采用的蛋白质的天然构象不对应的形式)获得的。因此，这些抗体不能识别细菌中蛋白质自然暴露的构象表位。
[0014]本专利技术人发现，靶向OprF膜抗原的特异性抗体或这些抗体的一部分，具有对于OprF蛋白的所有其天然线性和构象表位特别高的生物中和活性，因此针对由于铜绿假单胞菌引起的细菌感染有很好的治疗效力。
[0015]为了产生与铜绿假单胞菌的OprF蛋白特异性结合的抗体，本专利技术人开发了创新方法，其导致发现对以其天然膜形式的该蛋白质具有特别强亲和力的抗体。
[0016]示意性地，这种方法由以下组成：从含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的蛋白脂质体从灵长类动物中产生的免疫库中产生抗体。这也适用于铜绿假单胞菌的孔蛋白OprF以外的其他抗原。
[0017]更具体地，用于制备根据本专利技术的抗体或功能抗体片段的方法包括这样的步骤：产生蛋白脂质体，其中铜绿假单胞菌的OprF蛋白处于其天然和活性形式，从而暴露构象表位。该步骤可以通过在无细胞蛋白合成系统的存在下，将含有铜绿假单胞菌OprF蛋白的编码序列的表达载体与合成脂质体接触以形成反应介质来进行，该系统使蛋白质的转录和同时翻译成为可能。然后将该蛋白质插入合成脂质体的脂双层中以形成蛋白脂质体。在Maccarini et al.，Langmuir 2017，33，9988
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9996的出版物中特别描述了这样的步骤。OprF蛋白以适合具有天然构象和开放通道构象的方向存在于模仿铜绿假单胞菌膜的脂质体脂双层中。更具体地，OprF蛋白有利地以其两种形式(开放的和封闭的)存在于蛋白脂质体中，这两种形式天然存在于细菌膜中或由细菌释放的囊泡中以抵消免疫应答。特别地，由本专利技术人进行的蛋白脂质体分析表明，OprF蛋白：在脂质体膜中以正确的方向存在于其中；以其两种膜拓扑结构(开放的和封闭的，分别以8个和16个跨膜通路为特征)存在于其中；在脂质体膜中形成在其中的孔/通道；以低聚形式存在其中。
[0018]由本专利技术人开发的方法然后包括用这些蛋白脂质体免疫接种非人哺乳动物，优选猕猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))，然后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.针对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)OprF蛋白的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其特征在于其包含重链可变区和轻链可变区：
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所述重链可变区具有三个互补决定区(CDR)，所述CDR具有以下氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：VH
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CDR1：GYXaa1FXaa2Xaa3Xaa4G(SEQ ID NO：1)，其中Xaa1是苏氨酸残基或丝氨酸残基，Xaa2是丝氨酸残基或天冬酰胺残基，Xaa3是精氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且Xaa4是苯丙氨酸残基或酪氨酸残基，VH
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CDR2：INAXaa5TGKXaa6(SEQ ID NO：2)，其中Xaa5是谷氨酸残基或天冬氨酸残基，并且Xaa6是丙氨酸残基或丝氨酸残基，VH
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CDR3：VR，
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所述轻链可变区具有三个CDR，所述CDR具有以下氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：VL
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CDR1：SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO：3)，其中Xaa7是苏氨酸残基、天冬酰胺残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基或精氨酸残基，Xaa8是天冬酰胺残基、甘氨酸残基或丝氨酸残基，并且Xaa9是酪氨酸残基或苯丙氨酸残基，VL
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CDR2：Xaa
10
TS，其中Xaa
10
是甘氨酸残基、精氨酸残基或丙氨酸残基，VL
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CDR3：QQGXaa
11
Xaa
12
Xaa
13
(SEQ ID NO：4)，其中Xaa
11
是组氨酸残基或天冬酰胺残基，Xaa
12
是丝氨酸残基或苏氨酸残基，并且Xaa
13
是缬氨酸残基或异亮氨酸残基。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中Xaa3是精氨酸残基并且Xaa6是丙氨酸残基。3.根据权利要求1至2中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中Xaa1为苏氨酸残基，Xaa5为谷氨酸残基，并且Xaa
13
为缬氨酸残基。4.根据权利要求1至3中任一项所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中
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所述重链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：VH
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CDR1：GYTFSRFG(SEQ ID NO：5)VH
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CDR2：INAETGKA(SEQ ID NO：12)VH
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CDR3：VR
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和/或所述轻链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：VL
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CDR1：SSVTTNY(SEQ ID NO：16)VL
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CDR2：GTSVL
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CDR3：QQGHSV(SEQ ID NO：24)。5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中：
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所述重链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：VH
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CDR1：GYSFSSYG(SEQ ID NO：6)VH
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CDR2：INADTGKS(SEQ ID NO：13)VH
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CDR3：VR
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和/或所述轻链可变区的互补决定区(CDR)具有以下相应的氨基酸序列，或与这些序列具有至少80％同一性的序列：VL
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CDR1：SSVTTGY(SEQ ID NO：17)或SSVTTNY(SEQ ID NO：16)VL
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CDR2：GTSVL
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CDR3：QQGHTI(SEQ ID NO：25)或QQGNTI(SEQ ID NO：26)。6.根据权利要求1所述的单克隆抗体或所述抗体的功能片段，其中：
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【专利技术属性】
技术研发人员：让吕克，
申请(专利权)人：格勒诺布尔综合理工学院国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：