一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法技术

本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法。本申请提供了寡肽合成及纯化方法，包括：构建含有融合蛋白的表达载体质粒，融合蛋白由相互串联的内含肽和目标寡肽组成；将表达载体质粒转化至宿主菌中，并使宿主菌表达融合蛋白；将表达融合蛋白的宿主菌依次进行破碎和第一次过滤处理，收集含有分子量大于等于10KDa总蛋白的菌液；调节菌液的pH值小于7然后进行孵育以激活内含肽进行自切割，得到含有内含肽和目标寡肽的混合物；将混合物进行第二次过滤处理，收集含有分子量小于3KDa的目标寡肽。本申请有效解决现有寡肽生物合成方法中存在的纯化困难，操作繁琐和损耗大等问题。和损耗大等问题。和损耗大等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法


[0001]本申请属于生物
，尤其涉及一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法。

技术介绍

[0002]寡肽在护肤、保健和医疗等领域具有重要的应用价值，但其工业化合成方式仍然是一个很大的难点。传统的短肽合成方法是基于化学反应合成技术，这种方法需要复杂的反应步骤和剧烈的反应条件，会生成大量的副产物，严重影响降低了寡肽的产量和提高了提纯的难度。这种化学合成方式往往会造成较大的环境污染和产生有毒的副产物。因此，更加环境友好和产物单一的生物合成法在寡肽制备上具有很大的优势。生物合成法利用人工构建的遗传编码信息在宿主中高效快速的产生寡肽产物，具有合成成本低、效率高、副产物少等优势。为了能够将寡肽特异性地分离提纯出来，在设计人工构建的遗传编码信息时，需要在寡肽上游加上亲和标签(如His标签或GST标签)，并在标签和寡肽序列之间加上蛋白酶切割位点。整体的流程包括蛋白表达、菌体破碎、介质富集、目标蛋白洗脱、超滤除盐浓缩、蛋白酶切割、分子筛富集纯化等多道生产工艺，这使得寡肽的生物合成法变得极为繁琐，提高了生产的损耗和成本。因此，更加方便的寡肽生物合成及分离纯化技术，在寡肽的工业化生产上，是迫切的需求。

技术实现思路

[0003]鉴于此，本申请提供了一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法，有效解决现有寡肽生物合成方法中存在的纯化困难，操作繁琐和损耗大等问题。
[0004]本申请提供了一种基于过滤法的寡肽合成及纯化方法，包括：
[0005]步骤1、构建含有融合蛋白的表达载体质粒，其中，所述融合蛋白由相互串联的内含肽和目标寡肽组成；所述内含肽为产生C末端自切割的蛋白分子；
[0006]步骤2、将所述表达载体质粒转化至宿主菌中，并使所述宿主菌表达所述融合蛋白；
[0007]步骤3、将表达融合蛋白的宿主菌依次进行破碎和第一次过滤处理，收集含有分子量大于等于10KDa总蛋白的第一混合物；
[0008]步骤4、调节所述第一混合物的pH值小于等于7然后进行孵育以激活所述内含肽进行自切割，得到含有内含肽和目标寡肽的第二混合物；
[0009]步骤5、将所述第二混合物进行第二次过滤处理，收集含有分子量小于3KDa的目标寡肽。
[0010]具体的，所述目标寡肽为现有常规的寡肽或短肽，如乳四肽或四肽
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9等。
[0011]具体的，所述表达载体质粒可以为原核生物表达载体质粒或真核生物表达载体质粒，优选为原核生物表达载体质粒，将现有常规的原核生物表达载体质粒经过常规酶切和连接与融合蛋白结合，构建得到含有融合蛋白的表达载体质粒。
[0012]进一步的，所述原核生物表达载体质粒可以为大肠杆菌菌株表达载体质粒。
[0013]另一实施例中，所述目标寡肽的氨基酸数目为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个。
[0014]具体的，所述目标寡肽的氨基酸数目为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个。
[0015]另一实施例中，所述融合蛋白的数量可以为1个或复数个，所述融合蛋白的数量为2个时，两个相邻所述融合蛋白间以所述表达载体的核糖体结合位点RBS相隔。
[0016]另一实施例中，所述内含肽选自Ssp DnaB、Ssp DnaE、Mtu RecA、Mth RIR1、Sce VMA、MtuΔI
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CM和GP41
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1中的一种或多种。
[0017]另一实施例中，步骤2中，采用诱导表达剂诱导所述宿主菌表达所述融合蛋白。
[0018]具体的，步骤2中，通过强诱导表达环境；是指加入高浓度的诱导表达剂如IPTG，来快速大量地产生靶融合蛋白。
[0019]另一实施例中，步骤3中，所述破碎菌体方法为现有常规的破碎菌体方法，镜检染色直至没有明显的菌体。所述破碎的方式为加热破碎法、裂解液超声破碎法或高压破碎法中的一种。
[0020]具体的，所述加热破碎法中加热条件为：加热温度为50～70℃，加热时间为30～120min。
[0021]具体的，所述裂解液超声破碎法采用的裂解液包括20mM Tris和500mM NaCl，裂解液的pH为8.0，所述裂解液超声破碎法中超声条件为现有常规破碎菌体的超声条件。
[0022]另一实施例中，步骤3中，所述第一次过滤为：将破碎后宿主菌经过10KDa的滤膜。
[0023]具体的，步骤3中，所述破碎还可以包括离心过滤处理，如12000rpm，4℃离心20min，收集上清，将所述上清经过0.45um滤膜过滤处理。将破碎后宿主菌经过离心过滤处理，有利于菌液经过10KDa的滤膜。
[0024]具体的，步骤3中，将破碎后宿主菌经过离心过滤处理，然后将离心过滤处理的溶液经过10KDa的滤膜。
[0025]另一实施例中，所述滤膜选自10KDa的超滤管或/和10KDa的超滤膜包。
[0026]另一实施例中，步骤4中，采用酸性缓冲液调节所述第一混合物的pH值，所述酸性缓冲液选自pH 5～7的磷酸缓冲液和pH 5～7的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、pH 5～7哌嗪
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1,4
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二乙磺酸缓冲液中的一种或多种。所述酸性缓冲液优选为pH 5～6的磷酸缓冲液，其目的是在酸性条件下激活的内含肽自切割活性，释放出目标寡肽。
[0027]具体的，所述磷酸缓冲液的pH值为5，所述磷酸缓冲液加入体积为所述第一混合物体积的三分之一至十分之一，其目的是在酸性条件下激活的内含肽自切割活性，释放出目标寡肽。
[0028]另一实施例中，步骤4中，所述孵育的条件为37℃孵育2h或4℃孵育6～14h。
[0029]另一实施例中，步骤5中，所述第二次过滤处理为：将所述第二混合物经过3KDa的滤膜。
[0030]另一实施例中，所述滤膜选自3KDa的超滤管或/和3KDa的超滤膜包。
[0031]为解决目前寡肽的生物合成法存在的缺陷，本申请开发了一种基于过滤工艺的寡肽生物合成及纯化的方案，本申请的方法在设计人工构建的遗传编码信息时，在寡肽上游
连接有内含肽序列，通过生物合成产生内含肽
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寡肽融合蛋白。在破碎菌体后，先利用第一轮过滤技术去掉10KDa以下的蛋白分子，加入pH调节缓冲液，完成内含肽的自切割和寡肽的释放。最后利用第二轮过滤技术获得小于3KDa的蛋白分子，即可高效大量地获得目标寡肽。这种寡肽生物合成及纯化方案仅需要经过蛋白表达、菌体破碎、第一轮过滤、酸性环境释放寡肽和第二轮过滤技术共五个步骤，避免了传统生物合成法中复杂的蛋白纯化和蛋白酶切割方法，极大地提高了寡肽的生产效率和生产品质，适用于寡肽类物质的工业化大规模生产。
附图说明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种寡肽合成及纯化方法，其特征在于，包括：步骤1、构建含有融合蛋白的表达载体质粒，其中，所述融合蛋白由相互串联的内含肽和目标寡肽组成；所述内含肽为产生C末端自切割的蛋白分子；步骤2、将所述表达载体质粒转化至宿主菌中，并使所述宿主菌表达所述融合蛋白；步骤3、将表达融合蛋白的宿主菌依次进行破碎和第一次过滤处理，收集含有分子量大于等于10KDa总蛋白的第一混合物；步骤4、调节所述第一混合物的pH值小于等于7然后进行孵育以激活所述内含肽进行自切割，得到含有内含肽和目标寡肽的第二混合物；步骤5、将所述第二混合物进行第二次过滤处理，收集含有分子量小于3KDa的目标寡肽。2.根据权利要求1所述的寡肽合成及纯化方法，其特征在于，所述目标寡肽的氨基酸数目为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个。3.根据权利要求1所述的寡肽合成及纯化方法，其特征在于，所述融合蛋白的数量为复数个，两个相邻所述融合蛋白间以所述表达载体的核糖体结合位点RBS相隔。4.根据权利要求1所述的寡肽合成及纯化方法，其特征在于，所述内含肽选自Ssp DnaB、Ssp DnaE...

【专利技术属性】
技术研发人员：江翱，张志乾，吴奕瑞，刘丽花，胡玉成，王海梅，姚宛菲，王嘉鹏，
申请(专利权)人：广州市乾相生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：