嵌合CD3融合蛋白与基于anti-CD3的双特异性T细胞激活元件的联合表达制造技术

提供了一种编码嵌合CD3融合蛋白和基于CD3抗体的双特异性T细胞激活元件(BiTA)的核酸。还提供了包含所述核酸的载体、工程化免疫细胞，及其用途和预防肿瘤的方法。由CAB

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】嵌合CD3融合蛋白与基于anti
‑
CD3的双特异性T细胞激活元件的联合表达
[0001]背景


[0002]本公开主要涉及免疫治疗领域，具体地，本公开涉及嵌合CD3融合蛋白与基于anti
‑
CD3的双特异性T细胞激活元件的联合表达。
[0003]相关技术
[0004]近年来，免疫细胞疗法在血液肿瘤完全缓解率方面取得了前所未有的成功。2017年，已有两个靶向CD19的CAR
‑
T产品已成功上市，分别被批准用于治疗儿童及青少年急性白血病和非霍奇金淋巴瘤。
[0005]但利用免疫疗法治疗实体肿瘤，还存在两大难题：一方面，与CAR
‑
T疗法相伴随的严重、甚至致命的临床副作用仍是CAR
‑
T疗法临床应用的巨大风险，这些副作用主要包括细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)、巨噬细胞活化综合征、神经毒性等。而另一方面，在实体肿瘤的临床治疗中，CAR
‑
T疗法还未展现其显著的临床疗效。
[0006]WO2016070061(Zhao等人)描述了表达双特异性抗体和嵌合配体工程化活化受体(chimeric ligand engineered activation receptor,CLEAR)的工程化T细胞。然而，其所公开的内容仅限于受体/配体靶点PD1/PD
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L1和CD27/CD70、以及PD1或CD27 CLEARs的表达。
[0007]WO2016/054520(Kim等人)描述了表达工程化细胞表面蛋白的效应细胞以及使用所述效应细胞用于治疗疾病。在其中一个实施方案中，描述了表达工程化CD3e的效应细胞和双特异性T细胞衔接器(bispecific T cell engager,BiTE)的联合治疗。然而，在Kim的方法中，CD3e和BiTEs并不是在一个效应细胞中共表达，并且由于BiTE的低PK半衰期和毒性，需要进行连续低剂量输注。独立施用这些效应细胞和BiTEs不会在实体肿瘤微环境中产生协同作用。
[0008]因此本领域依然需要开发一种临床疗效好而临床副作用低的抑制实体肿瘤的治疗方案。
[0009]概述
[0010]本公开的目的包括提供一种临床疗效好而临床副作用低的抑制实体肿瘤的治疗方案。
[0011]本公开第一方面提供一种DNA构建体，其编码嵌合CD3融合蛋白(例如嵌合CD3e融合蛋白)以及基于anti
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CD3的双特异性T细胞激活元件。
[0012]在一个优选实施方案中，所述嵌合CD3是融合蛋白，所述融合蛋白包含能够被抗CD3抗体识别的一个或多个多肽，以及可选地包含选自下列的一个或多个：跨膜结构域(TM)、共刺激结构域和CD3信号激活结构域(如CD3ζ结构域)。
[0013]在一个优选实施方案中，所述基于anti
‑
CD3的双特异性T细胞激活元件是融合蛋白，所述融合蛋白包含一个或多个肿瘤抗原识别结构域和一个或多个抗CD3抗体片段，例如靶向CD3的单域抗体序列(VHH)、单链抗体可变区序列(scFv)和/或抗原结合片段(Fab)。在
protein)以顺式或融合形式表达，所述能够作为安全开关的蛋白包括诱导型Caspase 9(inducible Caspase 9,iCasp9),CD19,CD20,EGFR,HER2,CD30,CD19,c
‑
Met,Claudin 18.2,或其组合。
[0035]在另一个优选实施方案中，所述的基于anti
‑
CD3的双特异T细胞激活元件(BiTA)结构如下式II所示：
[0036]L
’‑
T1
‑
B1
‑
B2
‑
T2
ꢀꢀꢀꢀ
(II)
[0037]式中，
[0038]L
’
为无或信号肽序列；
[0039]T1为无或标签元件；
[0040]B1为肿瘤抗原识别区或CD3抗原识别区；
[0041]B2为结合CD3抗原的抗体片段或肿瘤抗原结合区；
[0042]T2为无或标签元件；
[0043]各
“‑”
独立地为连接肽或肽键。
[0044]在另一个优选实施方案中，所述的L
’
为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM
‑
CSFR、CD4、CD137、或其组合。
[0045]在另一个优选实施方案中，所述标签元件，包括标签蛋白、荧光素标记蛋白或酶标记蛋白。
[0046]在另一个优选实施方案中，所述标签蛋白包括FLAG蛋白(DNA SEQ ID NO.:SEQ 13,AA SEQ ID NO.:SEQ 14)、His蛋白(DNA SEQ ID NO.:SEQ 35,AA SEQ ID NO.:SEQ 36)。
[0047]在另一个优选实施方案中，所述B1为肿瘤抗原识别区，所述B2为CD3抗原识别区。
[0048]在另一个优选实施方案中，所述肿瘤抗原识别区包括一个或多个受体或配体结合域，抗体片段(包括单域抗体序列(VHH)，和/或单链抗体可变区序列(scFv))，和/或TCR序列。
[0049]在另一个优选实施方案中，所述的肿瘤抗原识别区B1包含单域抗体序列(VHH)、和/或单链抗体可变区序列(scFv)。
[0050]在另一个优选实施方案中，所述的肿瘤抗原选自下组：TSHR,CD19,CD123,CD22,CD30,CD171,CS
‑
1,CLL
‑
1,CD33,EGFRvIII,GD2,GD3,BCMA,Tn Ag,PSMA,ROR1,FLT3,FAP,TAG72,CD38,CD44v6,CEA,EPCAM,B7H3,KIT,IL
‑
13Ra2,间皮素(Mesothelin),IL
‑
11Ra,PSCA,PRSS21,VEGFR2,LewisY,CD24,PDGFR
‑
β,SSEA
‑
4,CD20,叶酸受体α,ERBB2(Her2/neu),MUC1,EGFR,NCAM,Prostase,PAP,ELF2M,肝配蛋白B2,IGF
‑
I受体,CAIX,LMP2,gp100,bcr
‑
abl,酪氨酸酶,EphA2,岩藻糖基GM1,sLe,GM3,TGS5,HMWMAA,邻乙酰基
‑
GD2,叶酸受体β,TEM1/CD248,TEM7R,CLDN6,GPRC5D,CXORF61,CD97,CD179a,ALK,聚唾液酸,PLAC1,GloboH,NY
‑
BR
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1,UPK2,HAVCR1,ADRB3,PANX3,GPR20,LY6K,OR5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸分子，其编码嵌合CD3融合蛋白和双特异性T细胞激活元件。2.权利要求1的核酸分子，其中，所述嵌合CD3融合蛋白包含能够被抗CD3抗体识别的一个或多个多肽，以及任选地包含选自下列的一个或多个结构域：铰链或接头区、跨膜结构域(TM)、共刺激结构域和CD3信号激活结构域。3.权利要求1的核酸分子，所述双特异性T细胞激活元件是包含一个或多个肿瘤抗原识别结构域和一个或多个结合CD3的抗体片段的融合蛋白。4.权利要求1的核酸分子，其中，所述融合蛋白具有下式I的结构：L
‑
EC
‑
H
‑
TM
‑
C
‑
CD3ζ
ꢀꢀ
(I)式中，L为无或信号肽序列；EC为多肽结合域，其可被CD3抗体识别并与CD3抗体结合；H为无或接头或铰链区；TM为跨膜结构域；C为无或共刺激信号分子；CD3ζ为无或源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；各
“‑”
独立地为连接肽或肽键。5.权利要求1的核酸分子，其中，所述双特异性T细胞激活元件具有下式II的结构：L'
‑
T1
‑
B1
‑
B2
‑
T2
ꢀꢀ
(II)式中，L
’
为无或信号肽序列；T1为无或标签元件；B1为肿瘤抗原识别区或结合CD3的抗体片段；B2为结合CD3的抗体片段或肿瘤抗原结合区T2为无或标签元件；各
“‑”
独立地为连接肽或肽键。6.权利要求4的核酸分子，其中，EC为来自或源自CD3e的多肽。7.权利要求6的核酸分子，其中，EC包含CD3e蛋白的第1位至104位，其序列如SEQ ID NO.:SEQ 3所示。8.权利要求4的核酸分子，其中，当C存在时，其为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30,CD40,CD70,CD134,4
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1BB(CD137),PD1,Dap10,CDS,ICAM
‑
1,LFA
‑
1(CD11a/CD18),ICOS(CD278),NKG2D,GITR,TLR2,或其组合。9.权利要求4的核酸分子，其中，当C存在时，其包含4
‑
1BB来源的共刺激信号分子，其序列如SEQ ID NO.:9所示，和/或CD28来源的共刺激信号分子，其序列如SEQ ID NO.:61所示。10.权利要求4的核酸分子，其中，当CD3ζ存在时，其是SEQ ID NO.:11所示的胞浆信号传导序列。11.权利要求1的核酸分子，其中，所述构建体与来自或源自Caspase 9(iCasp9),CD19,CD20,EGFR,HER2,CD30,CD19,c
‑
Met,Claudin 18.2,或其组合的多肽共表达。12.权利要求5的核酸分子，其中，B1是肿瘤抗原识别区，B2是...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志远，伊刚，曾竣玮，刘晓林，黄威峰，彭绍岗，
申请(专利权)人：普米斯生物技术苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：