一种低强度脉冲超声增强胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的方法技术

本发明专利技术公开了一种低强度脉冲超声增强胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术采用1.5MHz的正弦超声波，脉冲频率1.0kHz，脉冲时间200ms，间隙时间为800ms，平均强度为300mW/cm2，在相同的时间点干预胶质瘤干细胞1次/天，每次20分钟。低强度脉冲超声激活线粒体细胞色素家族b5和c产生单线态氧进而损伤胶质瘤干细胞端粒，诱导胶质瘤干细胞脱离静息期，增强胶质瘤干细胞对替莫唑胺的敏感性，抑制肿瘤生长，用于胶质瘤的治疗，具有重要的临床应用价值。具有重要的临床应用价值。具有重要的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种低强度脉冲超声增强胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体是一种低强度脉冲超声增强胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的方法。

技术介绍

[0002]胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，约占所有颅内肿瘤的46％。其高侵袭性、高增殖能力的特性导致患者预后很差，中位生存期只有14
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16个月。目前，胶质瘤的治疗策略并没有发生很大变化，手术结合放、化疗仍然是大多数患者的主要选择，但疗效有限。因此，探寻胶质瘤的优化治疗势在必行。
[0003]近年来，作为一种无创的物理疗法，声动力疗法(sonodynamic therapy,SDT)选择性、特异性地杀伤肿瘤的特性受到广泛关注。目前高场强脉冲超声(HIFU)已经广泛应用于治疗肿瘤，虽然避免了侵入性手术，但这种方法要么需要使用高强度的光束加热破坏细胞，要么需要在使用超声之前注入特殊造影剂，在破坏肿瘤细胞的同时也会损害健康的细胞。不同于HIFU对肿瘤细胞热能消融作用，低强度脉冲超声(LIPUS)主要依靠机械能发挥作用，几乎无副作用，现在多用于再生医学，具有促进骨折愈合，加速组织再生，增强溶栓和促进神经再生的特点。已有文献报道LIPUS可以促进间充质干细胞分化进而用于脊髓损伤治疗。目前，LIPUS应用于肿瘤治疗方面的文献较少，仅有的报道也仅局限在作用肿瘤细胞本身，尚无LIPUS调控肿瘤干细胞分化及其机制的报道。
[0004]肿瘤干细胞长期保持休眠静息状态，区别于快速增殖的肿瘤细胞，与肿瘤增长复发密切相关，具有放化疗耐受性。肿瘤干细胞的静息
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终末分化的转化也是目前的研究热点。目前的放化疗主要针对增殖期的肿瘤细胞，在肿瘤细胞分裂期发挥作用。而肿瘤干细胞多处于静息期，DNA复制停止，放化疗无法将其杀灭。
[0005]替莫唑胺(TMZ)为咪唑并四嗪类具有抗肿瘤活性的烷化剂，用于治疗成人顽固性多形性成胶质细胞瘤或复发性恶性神经胶质瘤的化疗药物。

技术实现思路

[0006]本专利技术就是为了解决肿瘤干细胞休眠静息状态时，放化疗无法将其杀灭的问题，而提供一种低强度脉冲超声增强胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的方法。
[0007]本专利技术是采取以下技术方案实现的。
[0008]一种低强度脉冲超声增强胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的方法，该方法系采用低强度脉冲超声参数为频率1.5MHz的正弦超声波，脉冲频率1.0kHz，脉冲时间200ms，间隙时间为800ms，平均强度为300mW/cm2，在相同的时间点干预胶质瘤干细胞1次/天，每次20分钟。
[0009]这样设计的本专利技术确定了低强度脉冲超声在胶质瘤干细胞中的促分化作用，明确了低强度脉冲超声作用于线粒体的cyt b5家族和cyt c家族产生单线态氧(1O2)，从而将机
械能量转化至调控细胞生物功能上，为物理治疗等机制探究工作提供了帮助；低强度脉冲超声能够增强胶质瘤干细胞对化疗药物的敏感性，加强替莫唑胺的毒性作用，明显抑制肿瘤生长，提示了可应用于胶质瘤的治疗，具有重要的临床应用价值。
附图说明
[0010]图1是LIPUS诱导GSC分化光学显微镜下图；
[0011]图2是LIPUS处理后干细胞标记物nestin表达流式细胞术分析图；
[0012]图3是LIPUS处理后干细胞转录因子实时定量PCR结果显示图；
[0013]图4是Brdu流式细胞术分析图；
[0014]图5是实时定量PCR分析端粒T/S比较图；
[0015]图6是中期染色体端粒FISH实验结果图；
[0016]图7是酶标检测LIPUS处理后GSC中1O2浓度图；
[0017]图8是LIPUS离体作用于重组合成的细胞色素b、c家族比较图；
[0018]图9是离体状态下LIPUS诱导产生1O2含量图；
[0019]图10 Annnexin V/7
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AAD流式细胞术分析图；
[0020]图11是LIPUS联合TMZ后体内胶质瘤生长的曲线示意图。
具体实施方式
[0021]以下将结合附图及实施例对本专利技术做详细的说明。
[0022]实施例1：
[0023]分析LIPUS诱导GSC分化
[0024]1.U87细胞诱导GSC：本实验中使用的U87细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。U87细胞用含有10％胎牛血清的MEM培养基(Gibco，USA)在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中连续培养。选取对数生长期的U87细胞，消化离心后，DMEM/F12重悬细胞漂洗1遍，收集细胞接种到含有EGF(20ng/mL)、bFGF(20ng/mL)、B27(1
×
)、N2(1
×
)的DMEM/F12无血清培养基，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中连续培养，待其培养7
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9天，形成细胞球样细胞球。
[0025]2.LIPUS干预GSC条件：设置LIPUS参数为频率1.5MHz的正弦超声波，脉冲频率1.0kHz，脉冲时间200ms，间隙时间为800ms，平均强度为300mW/cm2。LIPUS干预是1次/天，在相同的时间点进行，每次20分钟，连续干预3天。明场显微镜下观察发现Ctrl组GSC球体积较大、边缘圆润，LIPUS组GSC球体积较小，大小不均一，细胞之间变得疏松，连接不如Ctrl组紧密，细胞团周围有触角伸出，形态变得狭长，提示LIPUS改变了GSC成球形态，促进GSC伸出触角，趋向于非干细胞形态变化，参照图1，LIPUS诱导GSC分化，明场显微镜下观察发现LIPUS处理后GSC球体积明显变小，大小不均一，周围有触角伸出。
[0026]3.将GSC以2
×
106个/孔的密度接种于6孔板，每组3个复孔。LIPUS分别干预12、24和72小时，处理后收集细胞。胰酶消化、离心、弃上清，固定破膜，加入20μl Nestin(BD ebioscience)，用流式细胞仪检测其表达率。Nestin流式细胞术结果显示LIPUS干预GSC 12h、24h、72h后，nestin阳性干细胞球占比从90.8％降至57.3％，提示nestin阳性干细胞球随时间的迁移逐渐减少，而nestin阴性非干细胞逐渐增多，参照图2。
[0027]4.将GSC以2
×
106个/孔的密度接种于6孔板，每组3个复孔。LIPUS分别干预12、24和72小时，处理后收集细胞，TRIZOL法提取RNA，逆转录后进行荧光定量PCR扩增，检测CD133,Nestin，Sox2及Nango表达。PCR实验检测干细胞干性相关转录因子Nanog、Oct4、Sox2及干细胞标记物CD133、Nestin的基因表达水平，实验结果显示，LIPUS干预后各时间点Nanog、Oct4、Sox2、CD133和Nestin的表达均低于Ctrl组，参照图3，实时定量PCR结果显示LIPUS处理后干性维持相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低强度脉冲超声增强胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的方法，其特征在于：低强度脉冲超声参数为频率1.5MHz的正弦超声波，脉冲频率1.0kH...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫华，徐立霞，佟小光，宋思蓉，马栋斌，周岩，闻斌礼，
申请(专利权)人：天津市环湖医院天津市神经外科研究所，天津市脑系科中心医院，
类型：发明
国别省市：