基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法技术

本发明专利技术提供一种基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法。所述方法是将成球培养和免疫磁珠分选法联合用于肿瘤干细胞的富集和分离。具体如下：先将肿瘤细胞在无血清的成球培养基中进行初步干性成球筛选后，再结合多靶标免疫磁珠分选肿瘤干细胞。将两种方法相结合，可以显著改善肿瘤干细胞分选得率低，纯度低以及成瘤性低等问题。本方法不仅特异性、敏感性好，富集时间短，捕获效率高，并且制备方法简单，成本低，具有很强的实用性。本发明专利技术为肿瘤的诊断、治疗及预后提供有效手段。治疗及预后提供有效手段。

【技术实现步骤摘要】
基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法


[0001]本专利技术涉及生物医学检测领域，具体地说，涉及一种基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法。

技术介绍

[0002]原发性肝癌是全世界最常见恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命和健康。在过去的几十年里，尽管在肝癌诊断及治疗上取得了巨大的进步，但绝大多数肿瘤患者仍无法获得根治，容易复发和转移，对常规化疗产生耐药，由于各治疗手段的局限性，导致肝癌患者的生存率低下，迫切需要结合肝癌的发病机制进一步研究开发新的诊疗方法。肝癌肿瘤干细胞是近年来肝癌领域的一个较为重要的发现，对肝癌的发生、发展及复发转移提供了新的理论解释，为肿瘤的诊断和治疗开辟了一条新的思路。2001年，肿瘤干细胞(Cancer stem cell，CSC)这一概念被正式提出。肿瘤干细胞(CSC)假说认为肿瘤组织中存在极少量的瘤细胞充当着干细胞的角色，它们具有自我更新能力、无限增殖能力和高致瘤性等特点，使得肿瘤组织中具有自我更新能力的肿瘤细胞的数量不断增加，肿瘤组织能够不断增大且能驱动肿瘤的形成和生长。肿瘤干细胞理论的提出为肿瘤的发生、发展乃至术后复发提供了新的研究思路，同时也为癌症的治疗带来了新的曙光。但由于肿瘤干细胞含量极低、分离困难，给肿瘤干细胞的研究带来诸多不便。目前常用的分离方法为无血清培养法与流式分选法，但二者均存在一定的缺陷，因此，亟需建立一种新型、快速、简单的CSC筛选和富集系统对于CSC的研究具有重要意义。
[0003]CD133也称为Prominin-1，是高度糖基化的五次跨膜膜糖蛋白，常表达于神经原始细胞、上皮/内皮祖细胞谱系、造血干/祖细胞等，是目前用来标记或分选干/祖细胞的最常用的膜表面标志。越来越多的证据表明CD133已经成为众多肿瘤干细胞表面的特异标记分子，CD133蛋白不仅在神经干细胞、表皮干细胞等干细胞中有表达，在白血病干细胞、大肠癌干细胞、脑肿瘤干细胞等多种肿瘤干细胞中都有表达。研究表明，CD133高表达的肝癌患者生存期明显较CD133弱表达组的短，CD133的表达与原发性肝癌(HCC)患者的总生存期相关，细胞质表达CD133是影响肝癌患者总生存的非常显著的危险因素。CD133作为多种肿瘤共同的细胞表面标志物，通过CD133特异性分选干细胞，将有助于我们研究肿瘤干细胞的生物学特性、信号传导通路和耐放化疗机制。
[0004]EpCAM是一种在人类许多上皮组织、肿瘤组织和干细胞中均有表达的跨膜糖蛋白，包括几乎所有的腺癌、某些鳞癌、视网膜细胞瘤和肝癌。EpCAM不仅是肿瘤细胞增殖的标志，也是肝癌干细胞的表面标志。研究发现，肝癌患者体内存在循环干细胞样EpCAM+细胞，可作为肝癌根治性切除术后预后不良的一个重要指标。
[0005]CD13是锌黏合金属蛋白家族氨肽酶N，与肝癌转移、化疗耐药相关，肝癌干细胞系处于半静止状态的一种标志物。CD13在许多肿瘤细胞中高表达，在肿瘤细胞生长、侵袭、转移和血管生成中发挥重要作用。最近，Haraguchi等通过基于微阵列分析的表面标记筛选，将CD13作为一种候选肝癌干细胞标志物。
[0006]有效分离和富集肿瘤干细胞是对其深入研究的前提，但由于肿瘤干细胞含量低和缺乏特异性的标志物，它的分离、富集已成为肿瘤干细胞研究的瓶颈和难点之一。现有方法主要包括流式分选、免疫磁珠分选、侧群分选和悬浮球培养等方法，但都存在一定的缺陷性，不能有效地分离和富集肿瘤干细胞。目前所有的流式分选和磁分选技术都是基于抗体进行分选检测，但抗体分子量和空间位阻大导致多个抗体不适合同时进行多靶点分选。近年来多肽配体在生化分析、肿瘤诊疗等方面彰显出很强的优越性，与抗体相比结构更加稳定、成本低、分子量小，更容易与纳米材料整合如用于循环肿瘤细胞(CTC)的分离检测。CSCs筛选和富集方法系统对于CSCs的研究具有重要意义。因此，建立一种新型、简单快速、可靠的肿瘤干细胞分离富集方法，在不改变肿瘤干细胞表观遗传的基础上，分离和纯化肿瘤干细胞为后续的深入研究奠定基础，以便开展更有针对性的研究是目前肿瘤干细胞研究的热点之一。目前，已经报道的肝癌CSCs的生物标志物主要包括CD133、EpCAM、CD13和α2δ1等。然而，目前为止在肝癌中尚未有特异性干细胞标志物得到国际广泛认可。而仅以一个标志物来确定肿瘤干细胞是不够的，因此通过联合几种肝癌干细胞表面标志物组合来更准确地分离和鉴别肝癌干细胞，通过对它们的检测，表征和监测来更好地理解这些特殊细胞在肿瘤发生、转移中的生物学作用。而由于个体差异的存在，并非所有CSCs均一高表达同一种标志物，因此在使用特异性标记物筛选法时，需要多标志物联合使用，以提高筛选出CSCs的可能性。单一CSCs体外富集方法存在一定的局限性，因此，多种富集法联合应用使提高CSCs的富集效率和准确度成为可能。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是针对肝癌干细胞标志物表达的复杂性和多样性以及抗体捕获技术本身存在不足，提出利用组合多肽来替代抗体作为靶向分子的新的复合式肿瘤干细胞的富集和筛选方法，实现对微量CSCs高效、特异性地分离和检测。
[0008]本专利技术构思如下：CD133、EpCAM和CD13均可作为独立的干细胞标志物，但其独立仍有较大的局限性，存在一定的假阴性率。本专利技术将这三种肿瘤标志物联合起来，共同作为肝癌干细胞检测的指标，可更好地评估肝癌干细胞的生物学行为，使分离检测结果更准确，预后更精准。
[0009]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种多肽-磁性纳米颗粒(多肽免疫磁珠)，所述多肽-磁性纳米颗粒为偶联有靶向肿瘤干细胞标志物CD133、EpCAM和CD13的多肽的氧化铁磁性纳米颗粒。
[0010]针对肝癌干细胞标志物表达的复杂性和多样性，专利技术人选择目前公认的肝癌干细标志物CD133、CD13和EpCAM，设计合成其相应的交叉靶向多肽Pep-1：YEVHTYYLDGGCGGYRYEWEPIY和Pep-2：YIPEWEYRYEGGCGGLHYEVY(SEQ ID NO:1-2)，并将其修饰于磁性氧化铁颗粒表面用于肿瘤干细胞(特别是肝癌肿瘤干细胞)的分离纯化。
[0011]多肽Pep-1和Pep-2对CD133、CD13和EpCAM具有高特异性亲和能力。其中，多肽Pep-1与CD133、CD13的亲和系数Kd分别为35.6nM和86.3nM，多肽Pep-2与CD133和EpCAM的亲和系数Kd分别为35.6nM和14.2nM。
[0012]所述多肽-磁性纳米颗粒是由所述多肽的半胱氨酸侧链上的巯基与表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒通过迈克尔加成反应得到的。所述多肽-磁
性纳米颗粒可以是多价体，所述多价体是通过氧化铁颗粒表面多肽之间的酰胺键连接分子共价连接形成的。
[0013]所述表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒的粒径大小为50-300nm，优选为200nm左右。
[0014]所述多价体具有靶向CD133、CD13和EpCAM阳性的肿瘤干细胞的特性。分选到的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽-磁性纳米颗粒为偶联有靶向肿瘤干细胞标志物CD133、EpCAM和CD13的多肽的氧化铁磁性纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽为Pep-1和Pep-2，它们的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2所示。3.根据权利要求2所述的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽-磁性纳米颗粒是由所述多肽的半胱氨酸侧链上的巯基与表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒通过迈克尔加成反应得到的。4.根据权利要求3所述的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒的粒径大小为50-300nm，优选为200nm。5.多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：(1)采用固相肽合成方法合成多肽，得到多肽溶液；(2)制备表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒溶液；(3)将(1)的多肽溶液和(2)的氧化铁磁性纳米颗粒溶液混合孵育；其中，所述多肽为靶向肿瘤干...

【专利技术属性】
技术研发人员：王子华，胡志远，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：