一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法技术

本发明专利技术提出了一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法，其步骤如下：在血液肿瘤细胞的胚胎干细胞培养基中加入Delta

【技术实现步骤摘要】
一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是指一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法。

技术介绍

[0002]肿瘤是威胁人类健康的一种重要疾病，其中白血病是人体循环系统的肿瘤，近年来该疾病的发生呈显著增长态势，且呈现低龄化趋势。目前人们对白血病的治疗主要是化疗。虽然骨髓抑制被认为是治疗白血病和淋巴瘤的有效手段，但由于血液配型等异体抑制排斥作用的存在，严重限制了骨髓移植技术的广泛应用。化疗技术虽然能够显著抑制白血病和淋巴瘤的增殖，但并不能彻底治愈疾病。大约50年前，人们最早从髓性白血病的发生和演变规律中提出了肿瘤干细胞概念，并认为这些肿瘤干细胞是正常干细胞和/或祖细胞通过突变形成的。正常造血干细胞能够持续分化成造血细胞，如红细胞、血小板、白细胞(包括T
‑
淋巴细胞和B
‑
淋巴细胞)、中性粒性细胞等。肿瘤干细胞也能分化、增殖成具有基因缺陷的造血细胞系或未成熟的祖细胞。人们发现并验证肿瘤干细胞在肿瘤的发生、发展与恶化过程中的作用首先是从急性髓性白血病病人样品中分离出一种具有表面抗原CD96阳性的肿瘤细胞亚型2，这种肿瘤干细胞在肿瘤中的数目极少，但肿瘤的恶性程度很强，是肿瘤化疗耐药的重要原因之一，也是白血病化疗失败的重要根源。因此，寻找高效低毒、对肿瘤干细胞专一的肿瘤治疗方法和新的药物筛选模型是彻底治愈肿瘤疾患的主要技术瓶径。
[0003]从临床血液样品、骨髓或白血病细胞系中分离悬浮肿瘤干细胞仍然存在困难，主要原因是血液肿瘤干细胞数目极少。目前广泛采用的分离方法有两种：一种是通过标记肿瘤干细胞的特征表面抗原，采用流式细胞分选技术或免疫磁珠分选出富含肿瘤干细胞的组分。目前所使用的表面特征抗原主要有CD9、CD33、CD44、CD90、CD96、CD110、CD123等。由于采用单一表面抗原对肿瘤干细胞的区分能力具有局限性，用该法分选出的肿瘤干细胞数量少，分离过程中细胞受损伤以及干细胞的纯度不够高，是限制深入研究肿瘤干细胞的一个技术屏障。(2)研究肿瘤干细胞的另一种分选策略是通过细胞流式分选技术将血液肿瘤中的能排出荧光染料，如荧光染料Hoechst33342的细胞称为侧群细胞。由于侧群细胞只是相对富集了肿瘤干细胞，通过研究肿瘤侧群细胞的性质并不能全面反映肿瘤干细胞的性质。

技术实现思路

[0004]本专利技术提出一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法，解决了现有技术中肿瘤干细胞无法高效低毒的实现富集和无分化扩增的问题。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法，其方法步骤如下：
[0007](4)在血液肿瘤细胞的胚胎干细胞培养基中加入Delta
‑
like4、Jagged1和FGF2成分因子作为培养基主要组分；
[0008](5)向所述胚胎干细胞培养基中加入抑制GSK信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制
剂，进行半固体培养，血液肿瘤干细胞形成集落；
[0009](6)所述胚胎干细胞培养基的组成原料按体积比包括30
‑
100％的DMEM基础培养基、0
‑
70％的胚胎干细胞培养基HEScGRO、0
‑
2μg/ml的DII4、0
‑
1μg/ml的FGF2、0
‑
2μg/ml的Jag1、0
‑
1μg/ml的SCF、0
‑
1μg/ml的LIF、0
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1μg/ml的TGF
‑
β、0
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1μg/ml的TPO、0
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300nM的CHIR99021、0
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1μM的PD173074、0
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1μM的PD184352和0
‑
1μM的PD0325901。
[0010]作为优选，所述抑制GSK信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂为CHIR99021、PD173074、PD184352或PD0325901。
[0011]本专利技术的有益效果为：
[0012]通过在血液肿瘤干细胞的集落培养中，向胚胎干细胞培养基中加入Delta
‑
like4，Jagged1和FGF2成分因子为培养基主要组分，并向所述胚胎干细胞培养基中加入抑制GSK信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂，进行半固体培养，血液肿瘤干细胞可以形成集落，解决了现有技术中肿瘤干细胞无法高效低毒的实现富集和无分化扩增的问题。
附图说明
[0013]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0014]图1为人急性T
‑
淋巴母细胞瘤Hut
‑
102在含有本专利技术阐述的半固体琼脂培养基中接种培养过夜后形成Hut
‑
102干/祖细胞(Hut
‑
102S)集落的照片，细胞的放大倍数为100倍；
[0015]图2为人急性T
‑
淋巴母细胞瘤Hut
‑
102和其干/祖细胞Hut
‑
102S悬浮培养传代的细胞形态，其中Hut
‑
102的培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基，Hut
‑
102S为本专利技术公开的干细胞培养基。细胞的放大倍数为100倍；
[0016]图3为人早幼粒白血病K562细胞在半固体干细胞培养基中的克隆生长，细胞的放大倍数为100倍；
[0017]图4为人急性T
‑
淋巴母细胞瘤Hut
‑
102和其干/祖细胞Hut
‑
102S的相关干细胞抗原的表达。
具体实施方式
[0018]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0019]实施例1
[0020]T
‑
淋巴瘤的肿瘤干/祖细胞集落培养、扩增
[0021]人T
‑
淋巴细胞瘤株Hut
‑
102购自美国细胞库ATCC(TIB
‑
162)，细胞培养使用含10％胎牛血清(PAA，FCS500)的DMEM培养基(北京钮因华信科技有限公司，DM10140021)，在Coring公司生产的T
‑
25细胞培养瓶中培养，培养条件为37℃，5％CO2。细胞每两天传代一次。血液肿瘤细胞的集落培养在Cornin本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富集和无分化扩增悬浮肿瘤干细胞的方法，其特征在于，其方法步骤如下：(1)在血液肿瘤细胞的胚胎干细胞培养基中加入Delta
‑
like4、Jagged1和FGF2成分因子作为培养基主要组分；(2)向所述胚胎干细胞培养基中加入抑制GSK信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂，进行半固体培养，血液肿瘤干细胞形成集落；(3)所述胚胎干细胞培养基的组成原料按体积比包括30
‑
100％的DMEM基础培养基、0
‑
70％的胚胎干细胞培养基HEScGRO、0
‑
2μg/ml的DII4、0
‑
1μg/ml的FGF2、0
‑
2μg/ml的Jag1、0<...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄兵，殷勤伟，
申请(专利权)人：北京智能宝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：