富集和无分化扩增肿瘤干细胞的方法技术

本发明专利技术提出了一种富集和无分化扩增肿瘤干细胞的方法，其方法步骤如下：将实体肿瘤细胞放在干细胞培养基中进行贴壁培养，肿瘤干细胞被培养出来并逐渐形成集落；所述干细胞培养基由下述体积百分比的原料组成：0～30％的DMEM基础培养基和70～100％的HEScGRO胚胎干细胞培养基。本发明专利技术的有益效果如下：解决了现有技术中分离干细胞需要使用高质量单克隆抗体、分离成本高且分离出的肿瘤干细胞扩增却失去或改变其干细胞特征的问题，提高血液肿瘤干细胞筛选的效率。细胞筛选的效率。细胞筛选的效率。

【技术实现步骤摘要】
富集和无分化扩增肿瘤干细胞的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是指一种富集和无分化扩增肿瘤干细胞的方法。

技术介绍

[0002]实体瘤是肿瘤疾病中的主要种类，是威胁人类健康的一种重要疾病。关于实体瘤的起源，目前存在两种不同模型：一种模型认为肿瘤是一种多基因功能异常的疾病，细胞/组织在病变过程中，随着致癌基因以及表观遗传基因突变的增加，细胞/组织逐渐形成癌前病变、癌变细胞/组织以及恶性癌变细胞/组织；另一种模型认为肿瘤是由肿瘤干细胞增殖分化出来的。
[0003]肿瘤干细胞在肿瘤细胞/组织中的含量很少，却具有类似胚胎干细胞的自我更新能力，肿瘤干细胞是干细胞发生基因和表观遗传基因突变后形成的具有恶性增殖特征的一类干细胞，是肿瘤细胞化、放疗失败的重要因素，肿瘤干细胞最初是在白血病患者的肿瘤细胞中被分离出来，该肿瘤干细胞具有表面特征抗原CD96。随后在实体瘤中也发现并鉴定了肿瘤干细胞的存在，如在乳腺癌中存在一种ABCG2基因高表达的细胞亚群，具有肿瘤干细胞特征，另外还发现 ALDH1、CD24、CD44、CD90、CD133也是用来鉴定肿瘤干细胞常用生物标志物分子。
[0004]肿瘤干细胞的分离主要是从新鲜的肿瘤组织中分离，目前传统的分离方法主要有流式细胞分选方法或免疫磁珠。采用流式细胞分选方法获得的肿瘤干细胞纯度较高，可达95％以上，但分选过程会对细胞产生较大损伤；磁珠分选方法虽然条件比较温和，但分选的干细胞纯度较低，最高只能达到80％。上述两种方法面临的一个共同问题就是分离干细胞需要使用高质量的单克隆抗体，分离成本很高；另外分离出的肿瘤干细胞如何扩增而不失去或改变其干细胞特征仍然是一个当前没有解决的技术瓶径，是制约肿瘤干细胞研究以及开发新型肿瘤治疗技术的障碍。

技术实现思路

[0005]本专利技术提出一种富集和无分化扩增肿瘤干细胞的方法，解决了现有技术中分离干细胞需要使用高质量单克隆抗体，分离成本高、分离出的肿瘤干细胞扩增会失去或改变其干细胞特征的问题。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0007]一种富集和无分化扩增肿瘤干细胞的方法，其方法步骤如下：将实体肿瘤细胞放在干细胞培养基中进行贴壁培养，肿瘤干细胞被培养出来并逐渐形成集落；所述干细胞培养基由下述体积百分比的原料组成：0～30％的RPMI
‑
1640和 70～100％的DEME/F12。
[0008]作为优选，所述干细胞培养基中还包含0～1μg/ml的EGF、0～1μg/ml的 FGF
‑
b、0～1μg/ml的IGF、0～1μg/ml的PDGF、0～1μg/ml的SCF、0～1μ g/ml的TGF
‑
β、0～1μg/ml的LIF、0～300nM的CHIR99021、0～1mM的 PD173074、0～1mM的PD0325901和0～1mM的Y27632。
[0009]上述富集和无分化扩增肿瘤干细胞的方法能够有效筛选出肿瘤干细胞，通过抑制
GSK信号通路和酪氨酸激酶抑制剂达到有效抑制肿瘤干细胞分化，提高血液肿瘤干细胞筛选的效率。
[0010]本专利技术的有益效果为：
[0011]采用本专利技术的干细胞培养基进行肿瘤细胞的贴壁培养，使得肿瘤干细胞逐渐形成集落，该集落具有肿瘤干细胞特征，解决了现有技术中分离干细胞需要使用高质量单克隆抗体、分离成本高且分离出的肿瘤干细胞扩增却失去或改变其干细胞特征的问题。
附图说明
[0012]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0013]图1为人乳腺癌细胞MCF
‑
7在含有本专利技术所述干细胞培养基中形成的克隆集落；
[0014]图2为人前列腺癌细胞Du
‑
145在含有本专利技术所述干细胞培养基中形成的克隆集落；
[0015]图3为人前列腺癌细胞Du
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145干细胞克隆的磷酸酶染色性质；
[0016]图4为人乳腺癌细胞Du
‑
145经干细胞克隆培养后相关干细胞特征基因的表达。
具体实施方式
[0017]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]一种富集和无分化扩增肿瘤干细胞的方法，步骤如下：将实体肿瘤细胞放在干细胞培养基中进行贴壁培养，肿瘤干细胞被培养出来并逐渐形成集落；所述干细胞培养基由下述体积百分比的原料组成：0～30％的RPMI
‑
1640和70～ 100％的DEME/F12。
[0019]上述干细胞培养基中还包含0～1μg/ml的EGF、0～1μg/ml的FGF
‑
b、0～ 1μg/ml的IGF、0～1μg/ml的PDGF、0～1μg/ml的SCF、0～1μg/ml的TGF
ꢀ‑
β、0～1μg/ml的LIF、0～300nM的CHIR99021、0～1mM的PD173074、0～ 1mM的PD0325901和0～1mM的Y27632。
[0020]实施例1
[0021]人乳腺癌MCF
‑
7肿瘤干细胞的克隆培养与扩增
[0022]人乳腺癌MCF
‑
7购自美国细胞库ATCC，细胞培养使用含10％胎牛血清 (PAA，FCS500)的DMEM培养基，在Coring公司生产的T
‑
25细胞培养瓶中培养，培养条件为37℃，5％CO2。细胞每两天传代一次。在进行MCF
‑
7干细胞克隆培养时，首先将在细胞培养皿中培养至90％的交汇度细胞用胰酶消化，经生理盐水洗涤后，更换干细胞培养基，重新悬浮MCF
‑
7细胞，并以每孔5
‑
10 万个接种到24孔板的一个培养孔中，细胞继续培养，培养1天后发现有少量细胞增殖，其中的某些细胞呈不完整球形结构生长，培养至第3天，细胞进一步增殖，呈球形的细胞图进一步增大，至第14天时呈球形生长的细胞进一步增殖，而不呈球形增殖的细胞逐渐死亡，如图1所示。该细胞克隆经胰酶消化后，能够在干细胞培养基中继续生长，并形
成球型的细胞克隆。该细胞克隆具有肿瘤干细胞的特征，是一种MCF
‑
7干细胞。
[0023]实施例2
[0024]人前列腺癌Du
‑
145肿瘤干细胞的克隆培养与扩增。
[0025]人前列腺肿瘤Du
‑
145购自美国细胞库ATCC，细胞培养与MCF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富集和无分化扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于，其方法步骤如下：将实体肿瘤细胞放在干细胞培养基中进行贴壁培养，肿瘤干细胞被培养出来并逐渐形成集落；所述干细胞培养基由下述体积百分比的原料组成：0～30％的RPMI
‑
1640和70～100％的DEME/F12。2.根据权利要求1所述的一种富集和无分化扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于，所述干细胞培养基中还包...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄兵，殷勤伟，
申请(专利权)人：北京智能宝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：