生产多胺缀合物的酵母制造技术

本发明专利技术涉及在能够生产至少一种多胺的酵母细胞中的多胺缀合物的生产。该酵母细胞还包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因和至少一种多胺合酶编码基因，但是缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。该酵母细胞能够生产各种多胺

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产多胺缀合物的酵母


[0001]本专利技术总体涉及遗传工程化酵母，并且特别涉及能够生产多胺缀合物的这类酵母。

技术介绍

[0002]需要具有新颖作用机制的小分子来帮助处理当今最具挑战性的生物医学问题和农业问题。然而，几十年间，由目标是识别用于药物和农用化学品开发的先导化合物的合成化学产生的超过1.35亿的小分子，尽管通过了初始筛选，但是被逐步淘汰。显然，改善小分子的复杂性和多样性是必要的。实际上，在自然界中多样的化合物，即具有复杂结构的天然产物和它们的衍生物是容易得到的，数千年来其在疾病的研究和治疗中发挥了重要作用。特别地，多胺缀合物是一组多样并且数量上主要的植物次级代谢物，其展示出广阔的结构多样性和复杂性。由此，已经报道多项对这些化合物的有益性质的研究。例如，已经提议多胺
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谷胱甘肽缀合物，也被称为锥虫胱甘肽(trypanothione)，作为药物化学中的特异性分子探针和用于谷胱甘肽还原酶抑制剂的开发。
[0003]遗憾的是，由于其结构复杂性和在自然界中的低丰度，从传统的合成化学或自天然来源的提取均难以获得多胺类似物。已经寻求在快速生长、遗传上易处理的物种中基于微生物的生产作为天然产物及它们的衍生物的传统供应链的替代方案。特别地，面包师的酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已经用做细胞工厂用于生产许多不同的燃料、化学品、食品配料和医药品，特别是为了它的天然产物生产。
[0004]因此，期望开发用于多胺缀合物的发现和生产的新方法。

技术实现思路
<br/>[0005]提供能够生产多胺缀合物的酵母细胞是总体的目的。
[0006]通过实施方案满足该目的以及其他目的。
[0007]在独立权利要求中定义了本专利技术。在从属权利要求中定义了本专利技术进一步的实施方案。
[0008]本专利技术涉及能够生产谷胱甘肽
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多胺缀合物的酵母细胞。该酵母细胞能够生产至少一种多胺。该酵母细胞还包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因和至少一种多胺合酶编码基因，但是缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。
[0009]本专利技术还涉及生产谷胱甘肽
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多胺缀合物的方法。该方法包含在培养基中并且在适合于通过根据本专利技术的酵母细胞生产谷胱甘肽
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多胺缀合物的培养条件下培养所述酵母细胞。该方法还包含从培养基和/或从酵母细胞中收集谷胱甘肽
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多胺缀合物。
[0010]本专利技术提供用于各种谷胱甘肽
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多胺缀合物的生产的有效手段，所述谷胱甘肽
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多胺缀合物包括单取代和/或多取代多胺，诸如锥虫胱甘肽。因此本专利技术可以用作涉及传统的合成化学或自天然来源的提取以获得多胺缀合物的现有技术方法的有成本效益的替代方案。
附图说明
[0011]通过参考以下与附图一起的描述可以最好地理解实施方案，连同其进一步的目的和优点，其中：图1a至1f说明用于亚精胺和高级多胺(higher
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polyamine)过量合成的工程酵母代谢。
[0012]图2a和2b说明酵母中锥虫胱甘肽
‑
(SH)2的生产。
[0013]图3a和3b说明用于酵母中复杂的酚酰胺和锥虫胱甘肽
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(SH)2的生物合成的工程化途径。
具体实施方案
[0014]为了使得能够有效获取多胺缀合物的多样性，我们工程化了酵母代谢以过量生产一类复杂的多胺，例如亚精胺、高亚精胺(homo
‑
spermidine)、热精胺(thermospermine)和精胺。通过具有按需定制途径(tailoring pathway)的多样的多胺缀合物的生物合成证明该酵母平台的多用性。具体地，由计算机模拟辅助，我们系统地重构了酵母中心碳代谢和氮代谢、甲硫氨酸补救途径、腺嘌呤的补救途径、多胺转运机器和多胺降解途径，由此使得酵母能够在深孔(deep
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well)规模发酵中生产&gt;400 mg/l的亚精胺。此外，通过插入按需定制途径以及产生合成聚生体，我们证明了酵母中多胺缀合物(包括锥虫胱甘肽)的从头生物合成。
[0015]现在将参考其中展示本专利技术的实施方案的附图和实施例在下文中描述本专利技术。该描述并非旨在成为可以实施本专利技术的所有不同方式或可以添加至本专利技术的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案说明的特征可以并入到其他实施方案中，并且关于特定的实施方案说明的特征可以从该实施方案中删除。因此，本专利技术设想在本专利技术的一些实施方案中，可以排除或省略载于本文的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本公开，本文提出的对各种实施方案的很多变化和添加对于本领域技术人员将是显而易见的，它们不背离本专利技术。因此，以下描述旨在说明本专利技术的一些特定的实施方案，并且并非旨在详尽地指定其所有的排列、组合和变化。
[0016]除非本文另有定义，本文所使用的科学术语和技术术语将具有本领域普通的技术人员通常所理解的含义。
[0017]一般地，本文所述的与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学以及杂交的技术有关使用的名词是在本领域众所周知且通常使用的那些。
[0018]本文提及的常规方法和技术在，例如Molecular Cloning, a laboratory manual [second edition] Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989中，例如，在其第1.21章节"Extraction And Purification Of Plasmid DNA"、第1.53章节"Strategies For Cloning In Plasmid Vectors"、第1.85章节"Identification Of Bacterial Colonies That Contain Recombinant Plasmids"、第6章节"Gel Electrophoresis Of DNA"、第14章节 "In vitro Amplification Of DNA By The Polymerase Chain Reaction"和第17章节"Expression Of Cloned Genes In Escherichia coli")中更详细地解释。
[0019]本说明书通篇涉及的酶委员会(Enzyme Commission)(EC)编号(本文也称为"种类")是根据国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) (NC
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IUBMB)在其例如作为以下得到的资源"Enzyme Nomenclature" (1992，包括附录6
‑
17)中： "Enz本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.能够生产谷胱甘肽
‑
多胺缀合物的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够生产至少一种多胺；所述酵母细胞包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因；所述酵母细胞包含至少一种多胺合酶编码基因；并且所述酵母细胞缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞被工程化以用于多胺:谷胱甘肽连接酶的过量表达。3.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述谷胱甘肽
‑
多胺缀合物选自锥虫胱甘肽、N1‑
谷胱甘酰基亚精胺、N
10
‑
谷胱甘酰基亚精胺、N1,N
10
‑
双(谷胱甘酰基)精胺、N1,N5,N
10
‑
三(谷胱甘酰基)精胺和N1,N5,N
10
,N
14
‑
四(谷胱甘酰基)精胺。4.根据权利要求1
‑
3的任一项所述的酵母细胞，其中所述多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因选自锥虫胱甘肽合酶、谷胱甘酰基亚精胺合酶及其组合。5. 根据权利要求4所述的酵母细胞，其中所述锥虫胱甘肽合酶编码基因选自布氏锥虫指名亚种(Trypanosoma brucei brucei) TbbTryS和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与锥虫胱甘肽合酶TbbTryS具有至少80%的序列同一性的锥虫胱甘肽合酶。6. 根据权利要求4或5所述的酵母细胞，其中所述谷胱甘酰基亚精胺合酶(GSS)编码基因选自大肠杆菌(Escherichia coli) EcGSS和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与谷胱甘酰基亚精胺合酶EcGSS具有至少80%的序列同一性的谷胱甘酰基亚精胺合酶。7.根据权利要求1
‑
6的任一项所述的酵母细胞，其中所述至少一种多胺选自精胺、热精胺、对称
‑
高亚精胺、1,3
‑
二氨基丙烷、腐胺、尸胺、...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦久福，J，
申请(专利权)人：克里希有限公司，
类型：发明
国别省市：