一种合成熊果酸的重组酵母及其构建方法技术

本发明专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种合成熊果酸的重组酵母及其构建方法和应用，所述的重组酵母表达枇杷来源的CYP450酶，且可以高效合成熊果酸。效合成熊果酸。效合成熊果酸。

【技术实现步骤摘要】
一种合成熊果酸的重组酵母及其构建方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种高效合成熊果酸的酿酒酵母及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]熊果酸（UA）是一种天然的五环三萜类羧酸，存在于多种水果和植物中，如苹果、山楂、女贞子等。有研究表明熊果酸具有很多重要的药理功能和生理活性，例如通过介导某些药理过程、调节部分信号通路，熊果酸可以用于预防一些慢性疾病的发展，同时具有抗氧化，抗炎，抗癌和保肝作用，并具有诱导细胞凋亡的能力。但是，目前熊果酸在工业上的主要来源仍然是从植物中提取，这其中必定会受到土地、气候等客观因素的制约，同时会产生占用耕地、消耗有机试剂等问题，严重制约了熊果酸的大规模推广和应用。而随着合成生物学和代谢工程等学科的发展，利用微生物细胞工厂来生产三萜类化合物成为当下热点。
[0003]酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其具有遗传背景清晰、基因操作技术成熟、安全无毒等优势而被选为底盘宿主。例如：专利CN111205993A公开了一种生产熊果酸和齐墩果酸的重组酵母菌及其构建方法和应用，公开了分别使用CYP716A12、CYP716AL1和AtCPR1提高熊果酸和齐墩果酸的产量。

技术实现思路

[0004]本申请进一步通过关键酶挖掘与异源表达，构建熊果酸合成途径；通过提高乙酰辅酶A等前体的供应，强化酵母合成熊果酸的能力；进一步通过分析合成途径与内源代谢网络的辅因子关系，改造熊果酸合成途径的辅因子供给，提高熊果酸合成效率；最后通过发酵优化，探索出最适pH和最佳营养成分。以酿酒酵母高产熊果酸为目标，从辅因子和前体供应的角度解决熊果酸在酵母中合成效率低的问题，也为其他三萜化合物的高效合成提供新的思路和方法。
[0005]本专利技术的目的是提供一种高效合成熊果酸的酿酒酵母及其构建方法。专利技术人创造性的发现细胞色素P450酶Ej8656，转化进合成α
‑
香树脂醇（α
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amyrin）的酿酒酵母，可以提高其合成熊果酸的产量。为了加强前体乙酰辅酶A的供应，过表达乙醛脱氢酶ALD6并敲除线粒体转运蛋白MPC2得到酿酒酵母菌株WN29；分析合成途径与内源辅因子代谢网络间关系，过表达来自乳酸克鲁维酵母的甘油醛
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磷酸脱氢酶GaPC和硅酸杆菌的NADH
‑
rHMGR得到WN85。
[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种合成熊果酸的重组酵母。
[0007]优选的，所述的重组酵母表达CYP450酶。所述的CYP450酶来源于枇杷。
[0008]优选的，所述的重组酵母还表达CPR酶。所述的CPR酶包括但不限于来源于苜蓿（优选蒺藜苜蓿）、甘草和/或百脉根。
[0009]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的重组酵母表达CYP450酶和/或CPR酶。
[0010]优选的，所述的重组酵母过表达乙酰辅酶A前体合成途径的基因，过表达辅因子供
给基因，和/或，降低乙酰辅酶A前体消耗途径的基因的表达。
[0011]所述的乙酰辅酶A前体合成途径的基因选自乙酰辅酶A合酶（优选为ACS1/ACS2）、乙醇脱氢酶（优选为ADH2）和/或乙醛脱氢酶（优选为ALD6）的编码基因；所述的辅因子供给基因选自异柠檬酸脱氢酶（优选来源于酿酒酵母的IDP2）、苹果酸脱氢酶（优选来源于酿酒酵母的MAE1）、乙醛脱氢酶（优选为水稻基腐病菌（Dickeyazeae）的ADA、大肠杆菌（Escherichia coli）的eutE）、甘油醛
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磷酸脱氢酶（优选为乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）的GaPC）和/或NADH依赖性的羟甲基戊二酸还原酶（优选来源于硅酸杆菌（Silicibaterpomeroyi）的rHMGR）的编码基因；所述的乙酰辅酶A前体消耗途径的基因选自线粒体孔蛋白（优选为POR2）、线粒体转运蛋白（优选为MPC2）和/或柠檬酸合成酶（优选为CIT2）的编码基因。
[0012]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的重组酵母表达枇杷来源的CYP450酶Ej8656和蒺藜苜蓿来源的CPR酶MtCPR。
[0013]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的重组酵母表达枇杷来源的CYP450酶Ej8656、蒺藜苜蓿来源的CPR酶MtCPR、水稻基腐病菌（Dickeyazeae）的乙醛脱氢酶ADA以及敲除线粒体转运蛋白基因MPC2。
[0014]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的重组酵母表达枇杷来源的CYP450酶Ej8656、蒺藜苜蓿来源的CPR酶MtCPR、水稻基腐病菌（Dickeyazeae）的乙醛脱氢酶ADA、乙醛脱氢酶ALD6以及敲除线粒体转运蛋白基因MPC2。
[0015]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的重组酵母表达枇杷来源的CYP450酶Ej8656和百脉根来源的CPR酶LjCPR。
[0016]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的重组酵母表达枇杷来源的CYP450酶、百脉根来源的CPR酶LjCPR、来自乳酸克鲁维酵母的甘油醛
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磷酸脱氢酶GaPC和/或来自硅酸杆菌的NADH依赖性的羟甲基戊二酸还原酶rHMGR。
[0017]优选的，所述的重组酵母为可以合成α
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amyrin的酵母。
[0018]优选的，所述的重组酵母选自酿酒酵母、毕赤酵母、解脂假丝酵母、解脂耶氏酵母、异常汉逊氏酵母、粟酒裂殖酵母、黏红酵母、热带假丝酵母或产朊假丝酵母中的任一种。
[0019]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的重组酵母为酿酒酵母。
[0020]本专利技术的第二方面，提供了一种构建上述重组酵母的质粒，所述的质粒包含CYP450酶和CPR酶的编码基因，所述的CYP450酶来源于枇杷。
[0021]优选的，所述的CPR酶来源于苜蓿（优选蒺藜苜蓿）、甘草或百脉根。
[0022]本专利技术的第三方面，提供了一种上述重组酵母的构建方法。
[0023]优选的，所述的构建方法包括向酵母中导入CYP450酶的编码基因。所述的CYP450酶来源于枇杷。
[0024]优选的，所述的构建方法包括向酵母中导入CYP450酶和CPR酶的编码基因。通过CYP450酶和CPR酶的偶联提高熊果酸的产量。
[0025]优选的，所述的CPR酶来源于苜蓿（优选蒺藜苜蓿）、甘草或百脉根。
[0026]所述的构建方法包括向重组酵母中导入乙酰辅酶A前体合成途径的基因，和/或，导入辅因子供给基因，和/或敲除乙酰辅酶A前体消耗途径的基因。
[0027]所述的乙酰辅酶A前体合成途径的基因选自乙酰辅酶A合酶（优选为ACS1/ACS2）、
乙醇脱氢酶（优选为ADH2）和/或乙醛脱氢酶（优选为ALD6）的编码基因。
[0028]所述的辅因子供给基因选自异柠檬酸脱氢酶（优选来源于酿酒酵母的IDP2）、苹果酸脱氢酶（优选来源于酿酒酵母的MAE1）、乙醛脱氢酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成熊果酸的重组酵母，其特征在于，所述的重组酵母表达CYP450酶和CPR酶，所述的CYP450酶来源于枇杷。2.根据权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，所述的CPR酶来源于苜蓿、甘草或百脉根。3.根据权利要求2所述的重组酵母，其特征在于，所述的重组酵母过表达乙酰辅酶A前体合成途径的基因，过表达辅因子供给基因，和/或，降低乙酰辅酶A前体消耗途径的基因的表达；所述的乙酰辅酶A前体合成途径的基因选自乙酰辅酶A合酶、乙醇脱氢酶和/或乙醛脱氢酶的编码基因；所述的辅因子供给基因选自异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醛脱氢酶、甘油醛
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磷酸脱氢酶和/或NADH依赖性羟甲基戊二酸还原酶的编码基因；所述的乙酰辅酶A前体消耗途径的基因选自线粒体孔蛋白、线粒体转运蛋白和/或柠檬酸合成酶的编码基因。4.根据权利要求1
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3任一所述的重组酵母，其特征在于，所述的重组酵母为合成α
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香树脂醇的酵母，所述的重组酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颖，贾男，余源，李敬知，姜尧竹，李春，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：