一种生产甜茶苷的酿酒酵母及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种生产甜茶苷的酿酒酵母及其应用，在酿酒酵母菌株中表达甜茶苷合成基因并过表达ABC外排泵，ABC外排泵选自YOR1、PDR11和PDR12中的至少一种。本发明专利技术通过在酿酒酵母中构建甜茶苷合成途径，使酿酒酵母能够生成甜茶苷，并进一步应用启动子工程和基因工程对重组酿酒酵母进行改造，实现了以葡萄糖为底物从头合成甜茶苷，该重组酿酒酵母在发酵生产甜茶苷中表现良好。苷中表现良好。苷中表现良好。

【技术实现步骤摘要】
一种生产甜茶苷的酿酒酵母及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种生产甜茶苷的酿酒酵母及其应用。

技术介绍

[0002]甜茶苷(Rubusoside，Rubu)是主要从广西甜茶(茶、糖、药三位一体，“天然降血糖植物”)中提取的一种甜菊糖类的甜味剂。甜菊糖，又名甜菊糖苷，具有高甜度(蔗糖的300～450倍)、低热值(蔗糖的1/300)等特点，天然蔗糖替代品，被誉为“世界第三糖原”。甜菊糖是从甜叶菊中萃取甜菊糖苷净化而来的产物。甜茶苷除了作为甜味剂以外，还具有一定的药理作用，例如，降低血糖、激活胰岛素、抗癌活性等。但是植物中甜茶苷的产量较低 (甜茶苷含量低于5％)，且植物生长周期长、人工提取成本高，限制了甜茶苷的大量生产。为了解决这个问题，需要培育富含甜茶苷的新品种，但其所需要的先进技术和设备都仰赖大量资金。即便在甜菊糖的最大出口国中国，大多数生产商也无法负担得起。目前采用基因工程法构建基因工程菌株从头合成天然产物其具有低成本、原料不受限制、提取过程简单、无季节性、生产时间短，对环境污染小等诸多优点，从而受到广大学者的青睐。
[0003]微生物发酵法具有可持续性、绿色环保的社会经济效益，采用微生物发酵法生产莱甜茶苷是解决上述问题的有效途径。目前，关于甜茶苷合成途径关键基因的多个研究已指出(倪洪涛等，甜菊糖生物合成相关基因的研究进展；李铭敏等，甜菊糖苷的生物合成途径与生物转化制备策略的研究概述)，植物体内甜菊糖苷(SGs)的生物合成途径与赤霉素具有相关性，它们的共同前体是由焦磷酸异戊二烯(IPP)缩合成的牻牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP)，经过一系列酶的作用，催化形成甜菊醇和赤霉素，而甜菊醇再通过各类UDP
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糖基转移酶(UGTs)合成各类甜菊糖苷(stevioside，SGs)。具体地，牻牛儿焦磷酸合酶(GPPS)催化IPP和二甲基丙烯基二磷酸(DAMPP)形成牻牛儿焦磷酸(GPP)，法呢基焦磷酸合酶(FPPS)催化GPP形成法呢基焦磷酸(FPP)，FPP经牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(GGPPS)催化生成GGPP， GGPP在环化焦磷酸合酶(CPPS)的作用下脱氢形成环化焦磷酸(CPP)， CPP在贝壳杉烯合酶(KS)的催化下环化成贝壳杉烯，重排生成四环的贝壳杉烯，合成的贝壳杉烯转移到内质网中，在依赖细胞色素P450的单加氧酶(KO)的作用下转化成贝壳杉烯酸，贝壳杉烯酸在贝壳杉烯酸羟化酶(KAH) 的作用下，发生C13位脱氢氧化形成甜菊醇。甜菊醇经糖基转移酶UGT85C2、糖基转移酶UGT74G1等进行糖基化反应合成了各类SGs，比如甜茶苷。
[0004]中国专利CN201010569609.2公开了一种利用黄杆菌胞内酶提取和快速生产甜茶苷的方法，将黄杆菌活化后破碎，取上清，以甜菊糖为底物进行转化制备甜茶苷；中国专利CN201310460493.2利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法，在宿主细胞(大肠杆菌、毕赤酵母或酿酒酵母)中重组表达非甜叶菊来源的糖基转移酶UGTB1或IBGT，还表达了(a)牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶GGPPS，(b)古巴焦磷酸合成酶CDPS和贝壳烯合成酶KS，或双功能贝壳烯合酶，(c)贝壳烯氧化酶KO，(d)细胞色素P450氧化还原蛋白 CPR，(e)贝壳烯酸
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13α
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羟化酶，(f)UGT85C2糖基转移酶，(h)UGT74G1糖基转移酶，和(i)UGT76G1糖基转移酶。但上述方法生产的甜茶苷产量仍有待提高或并未生成甜茶苷，且目前未有关于微生物发酵法
ID NO.15所示。
[0021]酿酒酵母是又称面包酵母或者出芽酵母，是与人类关系最广泛的一种酵母，作为食品安全菌株已用于制作面包和馒头等食品、酿酒工业。近年来，学者们开始研究利用酿酒酵母生产天然产物，如青蒿酸、三七皂苷等。相比大肠杆菌而言，酿酒酵母具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌体污染的概率较低等优点，因此它也在基因工程领域发挥着重要作用。然而，酿酒酵母中没有甜茶苷合成的代谢通路。因此，本专利技术中将甜茶苷的合成途径整合至酿酒酵母，由于甜茶苷合成的前体IPP和DMAPP积累对细胞生长有毒，因此选用葡萄糖抑制型启动子P
gal1/10
，将细胞生产与生长解耦联，发酵初期培养细胞生长，待葡萄糖耗尽后，Pgal控制的甜茶苷途径基因开始表达促使产物合成以达到高效合成甜茶苷的效果。同时，强化甜茶苷合成前体 IPP和DMAPP合成过程中的关键限速酶的表达以提高IPP和DMAPP的生成，优化羟化酶P450强化中间产物向目标产物甜茶苷的转化，以及过表达INO2最大程度在酿酒酵母中积累甜茶苷。但是，甜茶苷在胞内积累会限制其产量进一步提升，因此本专利技术还通过鉴定并强化甜茶苷的外排系统进一步提高酿酒酵母中甜茶苷的生产性能。
[0022]本专利技术的第二个目的是提供一种上述生产甜茶苷的酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：
[0023](1)将基因表达框Pgal10
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ks插入酿酒酵母菌株基因组中的gal80位点，将启动子Pgal1/10与cpr1和ko的基因表达框整合至1014a位点，将启动子Pgal1与kah的基因表达框整合至1039a位点，将启动子Pgal1/10与ugt76g1 和ugt85c2的基因表达框整合至sap155b位点，将启动子Pgal1与fpps的基因表达框整合至1021b位点；其中，将基因表达框插入gal80位点，敲除了酿酒酵母中的gal80基因，解除了β
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半乳糖对P
gal1/10
的调控；
[0024](2)增加甲羟戊酸途径中的关键限速酶基因idi的拷贝数；切除羟基甲基戊二酰
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CoA还原酶基因hmg1的N端内质网定位信号肽获得thmg1，增加thmg1的拷贝数，强化甜茶苷合成前体；过表达INO2以扩大内质网；过表达ABC外排泵以强化其外排系统，ABC外排泵为YOR1、PDR11和PDR12 中的至少一种，得到上述生产甜茶苷的酿酒酵母菌株。
[0025]本专利技术的第三个目的是提供ABC外排泵YOR1、PDR11或PDR12在提高可生产甜茶苷酿酒酵母的甜茶苷产量中的应用，具体地，增强可生产甜茶苷酿酒酵母中YOR1、PDR11或PDR12的表达，可生产甜茶苷酿酒酵母为表达甜茶苷合成基因的酿酒酵母。优选地，过表达PDR11。更优选地，同时过表达YOR1、PDR11和PDR12。
[0026]进一步地，鉴定酿酒酵母中甜茶苷外排泵的方法为，预测酿酒酵母质膜上外排泵蛋白结构，通过与甜茶苷进行分子对接初步筛选出甜茶苷的外排泵，再通过ABC外排泵抑制剂进行进一步筛选，分别敲除筛选出的外排泵，对比对应酿酒酵母的甜茶苷产量，筛选出酿酒酵母中对甜茶苷外排起重要作用的外排泵。
[0027]本专利技术通过结构预测、分子对接以及ABC外排泵抑制剂筛选出甜茶苷的外排泵主要包含ABC外排泵家族，再通过敲除ABC外排泵，发现YOR1， PDR11，和PDR12敲除后，甜茶苷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产甜茶苷的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母表达甜茶苷合成基因并过表达ABC外排泵，所述ABC外排泵选自YOR1、PDR11和PDR12中的至少一种。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述甜茶苷合成基因为法呢基焦磷酸合酶基因fpps、贝壳杉烯合酶基因ks、贝壳杉烯酸氧化酶基因ko、甜菊醇合酶基因kah、UDP葡萄糖基转移酶基因ugt74g1和UDP葡萄糖基转移酶基因ugt85c2。3.根据权利要求2所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母通过双向启动子P
gal1/10
调控所述甜茶苷合成基因的表达。4.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：以酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2
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1C MATa；ura3
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52；trp1
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289；leu2
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3,112；his3Δ1；MAL2
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8C；SUC2为出发菌株。5.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母强化异戊烯基双磷酸盐
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异构酶基因idi和羟基甲基戊二酰
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，徐雅梦，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：