产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程领域和微生物发酵领域，公开了一种产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用。该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于出发菌株，重组菌株的多个细胞器中分别增强α

【技术实现步骤摘要】
产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域和微生物发酵领域，具体涉及一种产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用。

技术介绍

[0002]萜类化合物是最大的一类天然次级代谢产物，包含80000多个已知分子，具有高度的结构多样性和广泛的应用范围。尽管存在这种显着的多样性，但所有萜类化合物均由异戊二烯单元（C5）组成。根据C5单元的数量，萜类化合物一般可分为单萜类（C10）、倍半萜类（C15）、二萜类（C20）、三萜类（C30）和类胡萝卜素（C40），其中以倍半萜类最为丰富。α
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葎草烯是一种分子式为C
15
H
24
的单环倍半萜，由于其抗炎、抗过敏和抗癌活性而具有巨大的应用潜力。
[0003]目前，α
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葎草烯主要通过化学合成或者植物提取法进行工业化生产，然而，植物提取主要受到含量低，易受季节、地理位置等因素限制，这导致提纯等工艺的生产成本较高，化学合成存在步骤繁琐、收率低、催化剂昂贵和环境污染等缺陷也使其发展受到限制。因此，异源微生物合成作为生产α
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葎草烯的替代方法受到越来越多的关注，近年来，α
‑
葎草烯已经成功在多种宿主中实现了异源生产，但是所得的产量仍然很低，导致生产效率低、达不到工业化应用的要求。
[0004]随着代谢工程和合成生物学的快速发展，微生物正发展成为高附加值天然化合物绿色工业化生产的有效平台。解脂耶氏酵母是一种被认为是安全的（GRAS）非常规产油酵母，近年来在解脂耶氏酵母中成功开发了多种高效的合成生物学工具，为解脂耶氏酵母的基因操作提供了方便，因而越来越受到人们的关注。但是以解脂耶氏酵母为宿主进行萜类合成的研究还主要集中在细胞质中，这不利于探索解脂耶氏酵母生产萜类的潜力，阻碍了其工业化应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用，该重组菌株能够实现双细胞器产α
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葎草烯或者角鲨烯，具有较高的产量，发酵成本低。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种产萜类化合物的重组菌株，所述萜类化合物为α
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葎草烯或者角鲨烯，该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的多个细胞器中分别增强α
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葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量，或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量；其中，所述重组菌株的多个细胞器包括细胞质和过氧化物酶体，所述细胞质和所述过氧化物酶体中分别含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的α
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葎草烯合酶的基因，或者分别含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的角鲨烯合酶的基因。
[0007]本专利技术第二方面提供一种构建重组菌株的方法，该方法包括：对出发菌株进行基因工程改造以使得所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中分别增强α
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葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量，或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量；其中，所述增强α
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葎草烯合酶的活性的方式为在所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中外源引入编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的α
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葎草烯合酶的基因，所述增强角鲨烯合酶的活性的方式为在所述出发菌株的细胞质和过氧化物酶体中外源引入编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的角鲨烯合酶的基因。
[0008]本专利技术第三方面提供一种发酵产萜类化合物的方法，所述萜类化合物为α
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葎草烯或者角鲨烯，该方法包括：将上述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；或者，按照上述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。
[0009]本专利技术第四方面提供上述的重组菌株或上述的方法在制备萜类化合物中的应用，其中，所述萜类化合物为α
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葎草烯或者角鲨烯。
[0010]通过上述技术方案，本专利技术提供的重组菌株能够有效提高α
‑
葎草烯或者角鲨烯的产量，且具有原料再生、条件温和、绿色生产，不受时间、地点约束等优点。
[0011]在本专利技术最优选实施方式中，以解脂耶氏酵母为宿主菌株获得的重组菌株在发酵0h时添加50μM的硫酸铜溶液，发酵后得到的α
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葎草烯含量为96mg/g DCW，更加显著提高了发酵效果以及α
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葎草烯的产率。
[0012]生物保藏本专利技术的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）GQ3007，于2022年3月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.24525。
附图说明
[0013]图1是实施例2中各编码基因转入出发菌株的流程图。
具体实施方式
[0014]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0015]本专利技术使用的术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”通常都意味着统计学显著量的增加。然而，为避免疑义，术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”表示相比参比水平（例如出发菌株中的水平）增加至少10%，例如增加至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或上至并包括增加100%、或相比参比水平增加在10%到100%之间的任意量；或相比参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。
[0016]第一方面，本专利技术提供了一种产萜类化合物的重组菌株，所述萜类化合物为α
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葎
草烯或者角鲨烯，该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的多个细胞器中分别增强α
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葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量，或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量；其中，所述重组菌株的多个细胞器包括细胞质和过氧化物酶体，所述细胞质和所述过氧化物酶体中增强α
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葎草烯合酶的活性的方式为：所述细胞质和所述过氧化物酶体中分别含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的α
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产萜类化合物的重组菌株，所述萜类化合物为α
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葎草烯或者角鲨烯，其特征在于，该重组菌株由出发菌株经基因工程改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的多个细胞器中分别增强α
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葎草烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量，或者分别增强角鲨烯合酶的活性以及甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的通量；其中，所述重组菌株的多个细胞器包括细胞质和过氧化物酶体，所述细胞质和所述过氧化物酶体中分别含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的α
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葎草烯合酶的基因，或者分别含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的角鲨烯合酶的基因。2.根据权利要求1所述的产萜类化合物的重组菌株，其特征在于，所述α
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葎草烯合酶的编码基因ACHS2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述角鲨烯合酶的编码基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。3.根据权利要求2所述的产萜类化合物的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的细胞质和过氧化物酶体中α
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葎草烯合酶的活性增强时，将所述角鲨烯合酶的编码基因ERG9替换为铜离子抑制型启动子CTR2；其中，所述铜离子抑制型启动子CTR2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。4.根据权利要求1至3中任意一项所述的产萜类化合物的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的细胞质中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中过表达截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的编码基因tHMG1、磷酸甲羟戊酸激酶的编码基因ERG8、香叶基/法尼基二磷酸合酶的编码基因ERG20、甲羟戊酸激酶的编码基因ERG12、羟甲基戊二酰
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CoA合酶的编码基因ERG13、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的编码基因ERG19、乙酰乙酰辅酶A硫解酶的编码基因ERG10和异戊烯二磷酸异构酶的编码基因IDI中的至少一种；所述重组菌株的过氧化物酶体中甲羟戊酸途径增强的方式采用在所述出发菌株的过氧化物酶体中有效表达编码基因tHMG1、ERG8、ERG20、ERG12、ERG13、ERG19、ERG10和IDI中的至少一种；其中，所述编码基因tHMG1、ERG8、ERG20、ERG12、ERG13、ERG19、ERG10和IDI的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：6
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13所示；和/或，所述重组菌株的细胞质中乙酰辅酶A的通量增强的方式采用在所述出发菌株的细胞质中外源引入CoA<...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，郭琪，李珂，施天穹，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：